肽组合物的修饰以提高稳定性和递送效率制造技术

本公开的发明专利技术涉及修饰肽组合物以提高稳定性和递送效率的方法。具体地，本公开的发明专利技术涉及提高蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）调节肽组合物的稳定性和递送效率的方法。“治疗性肽组合物”包括“载体肽”和“货物肽”。“载体肽”是促进细胞吸收所述治疗性肽组合物的肽或肽内的氨基酸序列。所述“货物肽”是ＰＫＣ调节肽。本发明专利技术所述的对所述载体肽、所述货物肽或两者的肽修饰通过减少二硫键交换、物理稳定性、减少蛋白水解降解、和增加细胞吸收的效率而提高治疗性肽组合物的稳定性和递送效率。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请涉及用于提高生物活性试剂的载体进入活组织细胞的组合物和方法。所述组合物和方法包括与修饰的tat肽缀合的PKC调节肽，所述 修饰的tat肽为所述缀合物赋予提高的血浆稳定性，允许更有效地吸收 PKC调节肽进入细胞。
技术介绍
研究已经产生了许多具有作为治疗性组合物的潜力的肽。然而，由 于多种原因，尚未获得实现和利用针对细胞内靶标的肽的全部治疗性潜 力。其中最重要的一个原因是大部分治疗性肽不具有穿过细胞膜到达它们 的治疗靶标的能力。对该问题的一种解决方案是使用作用为运送货物 (cargo)肽进入靶细胞的载体肽D存在许多有效促进货物肽穿过靶细胞膜的载体肽的著名实例。 一个 实例是来源于HIV病毒TAT蛋白的肽序列。参见，美国专利号6，316，003, 其通过引用完全结合于此。另一种公知的载体肽序列是"聚-Arg"序列。 参见，例如，美国专利号6,306,993。在许多情形中，利用二硫键连接载体和货物肽而产生治疗性肽构建 体是解决使可溶肽靶向细胞内靶标的问题的有效策略。解释二硫键的用途 的一种理论认为， 一旦载体-货物构建体进入靶细胞，这两种肽可以通过 二硫键还原而分离。与保留所述载体-货物连接的其它连接机制相反，在 细胞内环境中的这种分离可以允许货物肽在细胞内更好的扩散。然而，在 这一点上，治疗性肽的施用仍然遇到许多挑战，诸如二硫键交换，蛋白水 解降解和细胞吸收的效率。指导控制这些问题的方法应该增加治疗性肽的 稳定性和功效。一种提高包括以二硫键与货物肽键合的载体肽的治疗性肽的功效的 方法是减少二硫键交换。二硫键交换通过允许一个载体肽将其货物肽换成 另一个载体肽而减少给定样品中的载体-货物肽构建体的量，由此导致产生载体-载体构建体和货物-货物构建体。仅有载体的构建体将不具有治疗 作用。所述货物-货物构建体将具有急剧减少的治疗作用，如果不是完全 消除的作用的话，因为所述载体肽能够将所述货物递送至其细胞内靶标。 同样地，控制二硫键交换的问题对于使载体-货物肽构建体的治疗潜力最 大化非常重要。使用治疗性肽所面对的另 一个问题是蛋白水解降解。肽是众所周知 的不稳定分子，并且在施用给受试者时经常容易受到蛋白水解攻击而分 解。在施用时降解的不稳定的载体肽将减少或者甚至消除所述货物肽的功 效，因为所述货物依赖于所述载体肽到达细胞内靶标。因此，控制或消除 治疗性肽的不稳定的性质的方法对于最大化载体-货物肽的治疗潜力也是 重要的。提高治疗性肽的细胞吸收效率是可能减少治疗性肽的功效或潜力的 另一个问题。针对货物肽最优化载体肽的序列和位置提供用于提高治疗性 肽构建体的稳定性和潜力的方法。
技术实现思路
本公开的专利技术涉及制备包括载体肽和PKC活性调节货物肽的治疗性 肽组合物的方法，由此形成的治疗性肽组合物相对于未修饰的治疗性肽具 有提高的稳定性和潜力。本专利技术的一个实施方案是减少治疗性肽组合物中 的二硫键交换的方法，所述方法包括提供这样的治疗性肽组合物，所述治 疗性肽组合物包括包含第一半胱氨酸残基的载体肽和包含第二半胱氨酸 残基的PKC活性调节货物肽，其中所述载体肽和所述货物肽通过在所述 第一和第二半胱氨酸残基之间的半胱氨酸-半胱氨酸二硫键连接；和引入至少一个紧邻所述第一或第二半胱氨酸残基、或两者的脂族残基，由此二 硫键交换率相对于未修饰的治疗性肽组合物减少。本公开的专利技术的另一个实施方案涉及减少治疗性肽组合物的蛋白水 解降解的方法，所述方法包括提供这样的治疗性肽组合物，所述治疗性肽组合物包括载体肽和PKC活性调节货物肽，并且其中所述载体肽与所述 货物肽连接；确定在所述载体肽、货物肽、或这两种肽上的蛋白水解不稳 定位点；和修饰在所述不稳定位点的氨基酸序列，以便使所述位点处的蛋白水解降解率相对于未修饰的治疗性肽组合物而减少。本公开的专利技术的另一个实施方案涉及提高治疗性肽组合物的血浆稳 定性的方法，所述方法包括提供这样的治疗性肽组合物，所述治疗性肽组 合物包括载体肽和PKC活性调节货物肽，并且其中所述载体肽与所述货物肽连接；修饰所述载体肽、货物肽、或二者的氨基端、羧基端或两端的残基，以便所述治疗性肽组合物的血桨稳定性相对于未修饰的治疗性肽组 合物得到提高。还打算在本文中公开组合物。所公开的组合物的一个实施方案包括蛋白激酶C (PKC)调节肽组合物，其包括与细胞内载体肽共价连接的 PKC调节肽，其中所述细胞内载体肽、所述调节肽、或二者均在N-端被 修饰。附图简述附图说明图1显示绘制CK释放相对于治疗性肽KAI-9706和KAI-1455的浓度的图。图2显示绘制梗死百分数相对于增加浓度的治疗性肽KAI-9706和 KAI-1455的图。图3A-3B显示绘制完整的治疗性肽KAI-9803、 KAI-9706 、和 KAI-1455在人血清中(3A)、猪血清(3B)、和大鼠血清(3C)中随时间存活的 百分数的图。 '图4显示包括通过二硫键连接的载体肽和货物肽的治疗性肽转化为 线性形式治疗性肽的图解。该线性肽(KP-01547)已在其氨基端和羧基端加 帽，并且包含短的氨基酸序列连接体。图5显示绘制完整的治疗性肽(线性的和非线性的)随时间(天数)的 百分数的图。图6显示比较治疗性肽随时间(天数)的稳定性的图。 图7显示示例的两种线性肽。图8显示比较各种PKC-A治疗性肽随时间的稳定性的图。图9显示比较各种PKC-P 治疗性肽随时间的稳定性的图。图10A-10D显示举例说明在26°C (IOA)和37°C (IOB)温度对KAI-9706的稳定性的影响，和在26。C (IOC)和37°C (IOD)温度对KAI 1455 的稳定性的影响的图。图11显示绘制在Langendorff体外局部缺血后测定中采用10分钟灌 流时，在存在增加浓度的KAI-9803或KAI-1355肽的条件下肌酸激酶释 放的图。图12显示描述构建KAI-1479的图解。图13A和13B显示来自再灌流研究的结果的柱状图，其中13A举例 说明实验过程中事件的时间线索，13B显示举例说明各种治疗性肽 (KAI-9803，KAI-1479，和KAI-1482)的保护特性的柱状图。图14显示SEQ ID NO:33的货物肽的图解，其中在所述肽的氨基端 具有一个半胱氨酸残基。图15A-15D显示治疗性肽多聚体的4种不同的可能的构型。 图16显示线性肽KP-1680,KP-1681,KP-1633,和KP-1678。 图17A-D显示测试溶液中随时间残余的肽的百分数的图。实施专利技术的方式本公开的专利技术涉及修饰肽组合物以提高稳定性和递送效率的方法。 具体地，本公开的专利技术涉及提高蛋白激酶C (PKC)调节肽组合物的稳定 性和递送效率的方法。"治疗性肽组合物"包括"载体肽"和"货物肽"。 "载体肽"是促进细胞吸收治疗性肽组合物的肽或肽内的氨基酸序列。所述 "货物肽"是PKC调节肽。本专利技术所述的对所述载体肽、所述货物肽或两 者的肽修饰通过减少二硫键交换、物理稳定性、减少蛋白水解降解、和增 加细胞吸收的效率而提高治疗性肽组合物的稳定性和递送效率。二硫键交换所公开的治疗性肽组合物的优选实施方案提供通过在两个连接性含 硫残基之间的二硫键与载体肽偶联的货物肽，所述连接性含硫残基在每个 肽中各有一个。无论本文档来自技高网...

【技术保护点】
减少治疗性肽组合物中的二硫键交换的方法，所述方法包括：　提供这样的治疗性肽组合物，所述治疗性肽组合物包括包含第一半胱氨酸残基的载体肽和包含第二半胱氨酸残基的ＰＫＣ活性调节货物肽，其中所述载体肽和所述货物肽通过在所述第一和第二半胱氨酸残基之 间的半胱氨酸－半胱氨酸二硫键连接；和　引入至少一个紧邻所述第一或第二半胱氨酸残基、或两者的脂族残基，由此二硫键交换率相对于未修饰的治疗性肽组合物减小。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：德里克麦克莱恩，
申请(专利权)人：凯制药公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]