重组ＰＡＣ１受体激动剂ＲＭＭＡＸ，其氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体的说，涉及重组PAC1受体激动 剂RMMAX及其表达方法与应用。
技术介绍
PAC1受体是垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, PACAP)的特定受体，参与介导PACAP 的多种生物学功能。PACAP是1989年发现的，由脑垂体分泌的或目的 组织自分泌和旁分泌的具有重要生物学功能的神经多肽，属于是促胰 液素/高血糖素/VIP家族中的新成员。PACAP的具有3个受体PAC1 是PACAP的特异受体；VPAC1和VPAC2是PACAP和血管活性肠肽(VIP)的共同受体；PACAP对3个受体具有相同的激动功能。其中 PAC1受体主要分布于中枢神经系统、周围神经系统以及睾丸、卵巢、 呼吸道、肺、胰腺等非神经组织内等。目前已证实由PAC1介导的 PACAP生物学功能有神经递质/调质、保护神经细胞；神经损伤修 复(眼角膜敏感度恢复，眼部手术后神经细胞突出形成)；调节血管； 促进激素分泌，调节内分泌平衡；调节性腺功能和生殖细胞的产生； 参与消化活动，调节能量代谢平衡；参与调节免疫系统；调节细胞增 殖分化；与摄食睡眠有关；与学习和记忆有关；与某些心理感受有； 与动物的生物钟有关；等等。鉴于PAC1介导了PACAP的多种生物学功能，因此开发PAC1的特 异激动剂和特异结抗剂具有巨大的药用开发的价值。例如PAC1受体 在眼部三叉神经特异高表达，而RMMAX通过PAC1有效促进角膜手 术后角膜敏感性的恢复及眼部三叉神经细胞突起的形成(神经产生)； 因此在眼睛角膜修复、神经修复及保护方面具有极大的应用价值。目前已发现的PACl特异激动剂maxadilan是从白蛉唾液腺中分离 的由61个氨基酸组成的多肽，本专利公开的RMMAX，由73个氨基酸 组成，与maxadilan有80^同源性，但是是通过基因工程方法制备获 得的重组多肽；而且RMMAX与maxadilan相比具有不同的N端和C端 序列及修饰，赋予RMMAX更高的稳定性和活性。RMMAX与PACAP 基本没有同源性，但能有效激活PACAP的特异受体PAC1，发挥相应 的生物学功能。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种具有高稳 定性和高活性的PAC1受体激动剂RMMAX。本专利技术的另一个目的是提供上述重组PAC1受体激动剂RMMAX的表达方法。本专利技术的进一步目的是提供上述重组PAC1受体激动剂RMMAX的应用。根据RMMAX的氨基酸序列，设计在原核表达的基因，采用基 因工程的原理和技术，结合蛋白内含肽(intdn)的可诱导剪切功能 实现两条目的多肽的高效制备，具体包括如下步骤(1) 设计并合成RMMAX基因，如SEQIDNO:l所示。采用6条引物三步法合成RMMAX基因引物F3和F4进行链延 伸反应；然后以其产物为模板，以F2和F5为引物，进行第一轮PCR; 最后以此PCR产物为模板，以F1和F6为引物，进行第二轮PCR， 获得RMMAX基因；所述引物Fl-6的核苷酸序列如下所示Fl: CAG GCG CAT CAT AGC AAC GTG CTG CAG ACC AGC GTGCAG ACC ACC GCG ACC TTT ACCAAC GTG ATC CATF5: GGTGGTGTCAT ATG GGC AGC ATT CTG TGC GAT GCG ACC TGC CAG TTT CGT AAA GCG ATTF6: GGTGGTT CTC GAG TTT GCC CGC TTT AAA TTC TTT TTT TTT CTG TTT CAT GCATTCTTT其中，N代表保护碱基，CAT ATG为Ndel酶切位点，CTCGAG 为XhoI酶切位点。(2) 用NdeI和XhoI进行酶切，将RMMAX基因隆到质粒pKYB 的Ndel和Xhol位点间，构建重组质粒pKY-RMMAX;(3) 两个重组质粒转化表达宿主菌E co//Strain ER2566,构建表 达工程菌；(4) 诱导剂IPTG诱导由目的多肽、蛋白内含肽和几丁质结合域 (Chitinbinding domain, CBD)组成的"三元"融合蛋白的表达；(5 )融合蛋白经几丁质柱纯化，硫醇诱导蛋白内含肽的N端切割，释放目的多肽C端硫酯；(6)透析多肽硫酯，使其在适当条件下水解产生稳定的C端硫代 羧酸水解产物。本专利技术的有益效果本专利技术所制备的PAC1受体特异激动剂RMMAX (73AA)与现有的PACl特异激动剂(68AA)相比，其C端和N端均具有特殊的氨基酸序列，并且在C端通过硫代羧酸修饰， 有效提高多肽的稳定性。本专利技术的RMMAX是新型的PACl受体的 特异激动剂，与PACl受体结合更强，具有更高激活PACl受体功能。 RMMAX可应用于与PACl受体密切相关的疾病的诊断和治疗。特别 是已有研究显示PACl介导神经生长与修复的功能，因此作为PACl 受体特异激动剂，本专利公开的重组多肽在神经修复方面(眼部手术 神经损伤修复)，将具有巨大的应用前景。本专利还首次发现RMMAX 具有高效升糖的作用，显示RMMAX可用于能量代谢相关疾病的研 究、诊断及治疗，例如高血糖、低血糖、糖尿病等。同时，利用本发 明的方法合成的RMMAX多肽硫脂的水解产物比化学合成的多肽的 稳定性高10倍以上。本专利技术的表达方法效率高、成本低，应用前景 广阔。 附图说明图1为RMMAX的制备示意图；图2为RMMAX基因的合成示意图；图3为pKY-MAX质粒的构建示意图；图4为pKY-MAX质粒的测序鉴定图；图5为RMMAX的表达和几丁质柱纯化；图6为RMMAX飞行质谱结果；图7为RMMAX调节血糖活性测定。其中，图5中，1:蛋白marker; 2:菌体IPTG诱导前；3:菌体EPTG诱导后；4:破碎上清；5:上样流出液l; 6:上样流出液2; 7:洗柱 流出液；8:目的多肽洗脱样品前10ml柱体积；9:目的多肽洗脱样品 后10ml柱体积；10:柱填料上结合的融合蛋。具体实施方式实施例l特异激动剂RMMAX的制备l.RMMAX基因的制备具体步骤见图1，按大肠杆菌的密码偏好性设计编码RMMAX的基因；设计6条引物，采用三步法获得RMMAX的基因(如图2): ①链延伸反应引物F3 (0.1A/uL) 5uLl， F4(0.1A/iiL) 5 u L， 10 X TaKaRa LA Buffer(含有4 mM MgCl2), 10 u L， dNTP 16 u L， H20 63 pL， 94°C， 10min;降至55。C，力Q TaKaRa LATaq酶1 u L，保温5 min; 72°C， 5 min;所得为延伸反应液。②PCR反应引物F2 (0.01A/ uL) lyL， F5(0.01A/ul)luL，①所得延伸反应液luL， dNTP 10 p L ， 10 X TaKaRa Ex Buffer 10 u L ， TaKaRa Ex Taq酶1 y L ， H20 76 uL， 94°C， 4 min; 94°C， 45 sec、 55°C， 45 sec 、 72°C， 60 本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组ＰＡＣ１受体激动剂ＲＭＭＡＸ，其氨基酸序列如ＳＥＱＩＤＮＯ：２所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：余榕捷，洪岸，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：81
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