一种海洋共生体的暂养、共生生物分离纯化的方法技术

本发明专利技术涉及海洋生物共生体的暂养、共生生物分离纯化的方法，暂养条件为：水温２３－２８℃、海水比重１．０００－１．１２１、盐度２６－３１‰、光照强度１００－２５０μｍｏＬｍ↑［－２］ｓ↑［－１］，光照周期１２／１２小时；分离纯化步骤为：洗净共生体的表面，取其组织放入匀浆器中，加入缓冲液和青霉素，匀浆、过滤、离心；沉淀用提取缓冲液重悬浮，重复匀浆、过滤离心步骤，直到提取的共生生物纯净为止。本发明专利技术的优点为：共生体的暂养设备简单、操作方便，不需要投喂任何食物，能长时间保持共生体的特性，为进一步研究打下基础；共生生物的分离纯化省时省力，对共生生物没有什么损害，能得到非常纯净的共生生物，以便进行培养和深入的研究。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及海洋生物共生体，具体地说是一种海洋生物共生体的实验室暂养、共生生物的分离纯化以及共生体之间的协同代谢产生的活性物质在医疗、卫生保健中的应用。
技术介绍
浩瀚的海洋是生命的摇篮，是生物早期进化的舞台。与陆地生物相比，海洋生物的重要特点是原始性、多样性和复杂性，所以海洋生物是研究生命起源与生物进化的极好材料。海洋生物生活在海水介质中，它们相互之间的关系更为紧密，特别是海洋生物之间的共生关系以及共生生物与环境之间的关系，这对于揭示生命的起源和生物的演化，认识生物进化的规律具有重要的指导意义。在这些共生关系中，海洋无脊椎动物和藻类的共生特别引人注意。关于共生体的研究，共生体的实验室暂养是非常基础而重要的一个环节，如果暂养不好，共生关系将被破坏，共生体也会很快死亡，继续研究也就无从谈起，珊瑚白化就是最好的例证。另外，有关共生现象的研究不是一朝一夕的事情，因此，共生体长期实验室暂养就为深入探索共生的本质提供了可能。共生生物与宿主之间是一种互相依存、互惠互利的协作关系，共生体之间协同代谢产生的活性物质在医疗、卫生保健中都将发挥越来越大的作用。作为一种内共生，单独研究共生生物在宿主体内的代谢或其他一些生理特性就显得非常困难，但这却引起了越来越多学者的关注。因此，为了更好的研究共生的机制，共生生物的生理和生化特性，分离纯化共生生物并在体外培养，就显得特别重要了。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种海洋共生体的暂养、共生生物分离纯化的方法，为进一步研究共生的本质以及共生体的应用打下基础。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为一种海洋共生体的暂养、共生生物分离纯化的方法，暂养条件如下水温23-28℃、海水比重1.000-1.121、盐度26-31‰、光照强度100-250μmoLm-2s-1，光照周期12小时光照，12小时黑暗；分离纯化步骤如下用过滤海水洗净共生体的表面，取共生体组织放入匀浆器中，然后加入分离提取缓冲液和青霉素，匀浆；然后过滤(可用300目筛网过滤)，滤液离心；沉淀用提取缓冲液重悬浮，重复匀浆、过滤离心的步骤，每次重悬浮的溶液均进行镜检，直到提取的共生生物纯净为止。当共生体组织湿重为2-4克时，加入分离提取缓冲液量为10-20mL、青霉素为0.05-0.08g；所述提取缓冲液的组成如下NaCl 3.506g/L，CaCl2.2H2O 1.47g/L，MgCl2.6H2O 5.48g/L，MgSO4.7H2O 7.148g/L，NaHCO30.168g/L，KCl 0.746g/L，pH值调至8.2。共生生物的培养如下将权利要求1最后一次离心后的沉淀用ASP-8A或F/2培养基重悬浮，取出接种于培养基中在光照培养箱中培养，培养条件温度22-27℃，光照强度50-100μmoLm-2s-1，光照周期12h/12h。在共生生物(即共生体)的培养过程中每天定时定量添加提前放置室温下的淡水，并在水族箱中安装蛋白质分离器，清洗蛋白质分离器，保持海水盐度的恒定以及水质的清洁。所述海洋共生体包括海葵、珊瑚等腔肠动物，也包括砗磲贝等瓣腮类动物。本专利技术的优点为共生体的实验室暂养设备简单、操作方便，不需要投喂任何食物，能长时间保持共生体的特性，为进一步研究打下基础；共生生物的分离纯化省时省力，对共生生物没有什么损害，能得到非常纯净的共生生物，以便进行培养和深入的研究。同时，共生体之间的协同代谢产生的活性物质可在医药、卫生保健中的应用。附图说明图1A与图1B为整理箱暂养与水族箱暂养技术之间的比较图；所采集的2只地毯海葵在整理箱中暂养28天时，就逐渐失去了美丽的颜色，出现明显的白化现象。29-56天，图1A中的一只仍然养在整理箱中，开始日光灯照明，但白化现象仍越来越严重，如图1A所示；图1B中的另一只则被放进水族箱中，接受珊瑚白、蓝灯光的照明，它已经逐渐恢复了美丽的的颜色(如图1B所示)；可见，珊瑚白、蓝灯光对共生藻的光合作用起着非常重要的作用。图2A为海葵共生藻的分离纯化可见光下的照片(10×10)；图2B为海葵共生藻的分离纯化可荧光下的照片(10×10)；由图2A和图2B的图片可以看出，分离的共生藻形态完整，没有什么损伤，也几乎看不到宿主海葵的组织碎片，说明分离的共生藻也是非常纯净的。图3为珊瑚活性物质提取物变性电泳图；收集到的六种收集物在进行变性电泳时只有第5个收集物有明显的带出现，并且分子量小于14kDa。具体实施例方式实施例1 海葵共生体海葵共生体实验室暂养过程中，适宜的光照是非常重要的，对光的波长、光的强度以及光照周期都有比较特殊的要求。具体条件如下水温23-28℃(最好为23-25℃)、海水比重1.000-1.121(本实例为1.021)、盐度26-31‰(本实例为29‰)、光照强度100-250μmoLm-2s-1(本实例为150μmoLm-2s-1)，光照周期12小时光照，12小时黑暗。另外，每天定时定量(500-1500mL)添加提前放置室温下的淡水，清洗蛋白质分离器，保持海水盐度的恒定以及水质的清洁；如图1B所示，按照这样的条件，不喂食暂养的海葵共生体长达一年之久仍然能保持共生体的特性，为深入研究共生体之间的协同代谢、协同进化打下了非常坚实的基础。共生生物(这里是指共生藻)的分离纯化步骤如下用过滤海水(0.45um的微孔滤膜过滤)洗净海葵共生体的表面，分别在海葵的不同位置剪下少许触手，放入玻璃匀浆器中，湿重为2-4克(本实例为2克)，然后加入10-20mL(本实例为10mL)分离提取缓冲液和0.05-0.08g(本实例为0.05g)青霉素，匀浆。然后用300目筛网过滤，滤液1000-2500g(本实例为2500g)离心5min，沉淀用40-80mL(本实例为40mL)提取缓冲液重悬浮，再匀浆，再过滤，离心，每次重悬浮的溶液均进行镜检，直到提取的共生生物纯净为止。用这样的方法，从海葵共生体中分离纯化的共生甲藻非常纯净，几乎没有宿主的组织，而且共生藻细胞也没有任何损害，如图2A和图2B所示。提取缓冲液的组成如下NaCl 60×10-3mol/L×58.44g/mol＝3.506gCaCl2.2H2O 10×10-3mol/L×146.99g/mol＝1.47gMgCl2.6H2O 27×10-3mol/L×203.30g/mol＝5.48gMgSO4.7H2O 29×10-3mol/L×246.47g/mol＝7.148gNaHCO32×10-3mol/L×84.007g/mol＝0.168gKCl 10×10-3mol/L×74.55g/L＝0.746g蒸馏水定容至1L，pH值调至8.2。共生生物(共生藻)的培养如下最后一次离心的沉淀用15mL ASP-8A培养基重悬浮，取5mL接种到250mL的三角瓶中，分别加入50mL培养基，在光照培养箱中培养。培养条件温度23-26±1℃，光照强度50-100μmoLm-2s-1，光照周期12h/12h。将2个盛有自来水的烧杯置于培养箱中保持湿度恒定。由于共生生物长期适应宿主的体液环境，他们的体外培养则具有相当高的要求，其难度也是相当大的。本专利技术体外培养共生生物所用的的培养基如下ASP-8A，F/2等，具体成分略。实施例2 柳珊瑚活性物质的提取柳珊瑚的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海洋共生体的暂养、共生生物分离纯化的方法，其特征在于：暂养条件如下：水温２３－２８℃、海水比重１．０００－１．１２１、盐度２６－３１‰、光照强度１００－２５０μｍｏＬｍ↑［－２］ｓ↑［－１］，光照周期１２小时光照，１２小时黑暗； 分离纯化步骤如下：用过滤海水洗净共生体的表面，取共生体组织放入匀浆器中，然后加入分离提取缓冲液和青霉素，匀浆；然后过滤，滤液离心；沉淀用提取缓冲液重悬浮，重复匀浆、过滤离心的步骤，每次重悬浮的溶液均进行镜检，直到提取的共生生物纯净为 止。

【技术特征摘要】
1.一种海洋共生体的暂养、共生生物分离纯化的方法，其特征在于暂养条件如下水温23-28℃、海水比重1.000-1.121、盐度26-31‰、光照强度100-250μmoLm-2s-1，光照周期12小时光照，12小时黑暗；分离纯化步骤如下用过滤海水洗净共生体的表面，取共生体组织放入匀浆器中，然后加入分离提取缓冲液和青霉素，匀浆；然后过滤，滤液离心；沉淀用提取缓冲液重悬浮，重复匀浆、过滤离心的步骤，每次重悬浮的溶液均进行镜检，直到提取的共生生物纯净为止。2.按照权利要求1所述的海洋共生体的暂养、共生生物分离纯化的方法，其特征在于所述提取缓冲液的组成如下NaCl 3.506g/L，CaCl2.2H2O1.47g/L，MgCl2.6H2O 5.48g/L，MgSO4.7H2O 7.148g/L，NaHCO30.168g/L，KCl 0.746g/L，pH值调至8.2。3.按照权...

【专利技术属性】
技术研发人员：王广策，朱葆华，尤丽莉，闫萧駰，曾呈奎，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]