用于检测和测定绿原酸的抗体、方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供包括绿原酸或其衍生物的半抗原，与赋予抗原性的载体物质结合的前述半抗原的免疫原，与标记试剂结合的前述半抗原的偶联物（包被原），以及抗前述免疫原的抗体，该抗体能与完整的绿原酸中的至少一种结构性抗原决定部位结合。本发明专利技术还提供用于检测或定量样品中绿原酸的方法和试剂盒，以及前述偶联物和前述抗体在检测或定量绿原酸中的用途。本发明专利技术对绿原酸具有特异性，可用于样品中检测绿原酸的存在和测定绿原酸的含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及小分子半抗原的抗体及其制备方法与应用，特别是涉及绿原酸及其衍生物的抗体及其制备方法与应用。
技术介绍
本专利技术涉及用于检测和定量绿原酸的方法和试剂盒，以及其中使用的半抗原、免疫原、偶联物(conjugate)和抗体。其中"检测"是指定性分析物质是否存在。其中"测定"是指对物质进行定量分析。绿原酸(Chlorogenic acid，以下简称CA),分子式C16H1809，分子量354.30，是由咖啡酸(Caffeic acid)与奎尼酸(Quinic acid， l-羟基六氢没食子酸)生成的缩酚酸，异名咖啡鞣酸，系统名1， 3， 4， 5-四羟基环己烷羧酸-(3， 4-二羟基肉桂酸酯)，化学名3-0-咖啡酰奎尼酸(3-0-caffeoylquinic acid)。中药或中药复方是一个复杂的巨系统，其中的化学成分具有结构多样性和复杂性的特点。揭示中药或中药复方化学成分在体内靶器官的分布，细胞或亚细胞定位，以及体内分布的动态变化，时量一时效关系等，是阐明中药或中药复方作用耙点以及作用机理的关键环节。绿原酸作为抗菌解毒、消炎利胆的主要有效成分，是金银花、杜仲、忍冬藤、鱼腥草、茵陈、栀子、清开灵注射液等药材和中成药，在药典或国家标准中规定的定性和定量的指标成分。从相关文献可知，针对绿原酸的定性与定量，目前建立了多种检测和测定分析方法，如薄层层析法、HPLC法，HPLC-MS法等。其中最常用的方法是高效液相色谱法。但含绿原酸的生物样品(包括血浆、尿、唾液等)含有大量的影响含量测定的蛋白质及内源性物质；同时绿原酸可能呈结合状态，必须经过处理，排除内源性杂质和代谢物的干扰，使结合状态的绿原酸游离后才能测定；同时还需要浓縮以满足仪器检测灵敏度的要求，处理程序复杂，费时费力；同时由于绿原酸进入体内后，组织中的分布是极其微量的，即使经过富集，进行含量测定仍是极其困难的。另外，对于绿原酸在靶器官和组织中分布，以及细胞和亚细胞定位的研究，需要通过免疫组织化学和western-blot等方法，但由于缺乏绿原酸的抗体，阻碍了此方面的研究。因此，有必要开发出一种用于检侧和测定生物样品中绿原酸的方法，对阐明相关药材或复方的作用机理，以及其体内分布和代谢研究，将具有特别的价值。
技术实现思路
本专利技术的半抗原绿原酸可提供确定的结构性抗原决定部位，但是它本身并不具备免疫原性，因此必须要偶联到适宜的赋予抗原性的载体物质上，这样所形成的免疫原才会在注射到宿主动物体内后诱发免疫应答。因此，本专利技术提供一种如下结构的免疫原-o其中R是0至6个碳的烷基桥(连接半抗原与载体物质的桥)，优选R = 0，即Pl直接与绿原 羰基碳原子结合，或R是C1-C6取代或未取代的、直链或支链的、饱和或不饱和的亚烷基， 更优选R是C1-C4未取代的、直链的、饱和的亚垸基。Pl是赋予抗原性的载体物质。载体物质选自蛋白质、蛋白质片合成的多肽或半合成的多 肽。其中蛋白质、蛋白质片段选自白蛋白、血清蛋白、球蛋白、目镜蛋白和脂蛋白，优选为 牛血清白蛋白、卵清蛋白、牛丙种球蛋白、甲状腺素结合球蛋白、锁眼形血蓝蛋白(keyhole limpet haemocyanin， KLH)，更优选自锁眼形血蓝蛋白或牛血清蛋白(BAS)。合成多肽或 半合成多肽是具有足够数量的可利用氨基的合成聚氨基酸，优选多聚赖氨酸。合成或天然聚 合物是带有反应官能基的聚合物材料，特别是能够结合到半抗原产生免疫原的碳水化合物、 酵母或多糖。半抗原的制备本专利技术描述了半抗原绿原酸在羧基处或任一羟基处与赋予抗原性的载体 物质发生的偶联作用，产生免疫原。为了让半抗原的结构特征充分暴露，可在-C00H位点上 接上一个连接臂。据此以绿原酸为起始原料，同时以氯化亚枫，氨基丁酸或氨基己酸等为原 料，经过二步反应，合成了半抗原2和3。产物2和3纯化后分别经质谱(MS)和核磁共振 氢谱和碳谱(1丽MR和13CNMR)确证。免疫原的合成本专利技术的半抗原和蛋白质载体的连接可使用本领域己知的任何连接方 式。例如但不限于碳二亚胺法(EDC )、戊二醛法等。采用碳二亚胺法制备缀合物和免疫原时， 是将0. 2毫摩尔的半抗原绿原酸溶解在N, N-二甲基甲酰胺中，加入1. 5当量的二环己基碳二 亚胺和3当量的N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应过夜，离心，取上清液加入到10-20mg/mL 的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，搅拌反应1-6小时，装入透析袋，分别用蒸馏水和0. Olmol/L 的PBS缓冲溶液透析3-5d，分装保存于-2(TC的冰箱中。合成免疫原的分析方法为了确认载体物质上结合有适当的半抗原，在免疫前，使用紫 外分光度法或矩阵辅助紫外激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)对每个免疫原进行评估。绿原酸免疫原反应物和产物的吸收峰相比(200nm-400nrn)，可判断是否偶合，并根据 反应物和产物的摩尔吸光系数计算偶联物与半抗原的比例。使用voyager STR生物分光度测量方法研究站激光解析质谱与延迟萃取结合进行MALDI -TOF质谱e将每个要分析的等分试样在0. 1%的三氟乙酸水溶液中稀释制成lmg/ml的试样溶 液。使用芥子酸基质和牛血清白蛋白作为外标分析等分试样(luL)。对于优选的载体物质，牛血清白蛋白或KLH而言，优选半抗原与蛋白质的结合比为6-15:第二方面，免疫检测时需要将绿原酸与标记试剂进行偶合。因此，本专利技术提供一种如下 结构的偶合物； O其中R是0至6个碳的烷基，P2是可检测的标记试剂，标记试剂选自酶、发光物质、放射性 物质或它们的混合物，更优选地标记试剂是过氧化物酶。最优选地标记试剂是辣根过氧化物 酶(HRP)。发光物质选自生物发光物质、化学发光物质或荧光物质。偶合物的合成利用混合酸配法，但不限于此法，可以采用已知的其他偶合方法。将0. 25 毫摩尔半抗原绿原酸溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，加入60uL正三丁胺和30uL氯甲酸丁酯， 室温下反应l-2小时，反应液加入到10-20mg/mL的卵清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，搅拌反应 1-4小时，装入透析袋，分别用蒸馏水和0.01niol/L的PBS缓冲溶液透析3-5d，分装保存于 -20匸的冰箱中。另一方面，本专利技术涉及对于本专利技术第一方面的免疫原产生的抗体，这些抗体能够至少与 一个绿原酸结构上的表位结合，优选与完整的绿原酸结构表位相结合，该抗体是多克隆的， 或是单克隆的，优选为单克隆抗体，且具有对绿原酸的特异性，并对于结构上相关的咖啡酰 基类化合物交叉的反应活性应低于10%，优选低于5%，更优选低于线，最优选低于0.5%。免疫检测时要将该抗体固定在支撑底物上。优选地，该方法进一步包括将所述血清抗体 固定到支撑底物上，优选固体支持物，最优选聚苯乙烯固体支持物。本专利技术进一步提供一种制备抗体的方法，该方法包含通过重复给予根据本专利技术的绿原酸的免疫原免疫动物，优选脊稚动物，最优选哺乳动物，并收集从免疫动物得到的血清的步骤。 另一方面，本专利技术包括在试样中检测或测定绿原酸的方法，该方法包括用本专利技术的偶合物或其混合物和本专利技术的抗体或其混合物接触试样；检测或测定结合的缀合物的数量；并且从标准曲线推断试样中绿原酸的存在或数量。另一方面，本专利技术还描述了如何将针对这种免疫原产生的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种如下通式的免疫原：　＊＊＊　其中Ｒ是０至６个碳的烷基桥（连接半抗原与载体物质的桥），Ｐ↓［１］是赋予抗原性的载体物质。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王庆国，赵琰，屈会化，任会明，蒋兴凯，杨爱玲，李翼飞，
申请(专利权)人：北京中医药大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]