本发明专利技术涉及一种检测病毒核酸的方法及试剂盒，属于生物技术领域。本发明专利技术是一种快速、等温的甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒ＲＮＡ扩增方法，整个反应有赖于ＡＭＶ逆转录酶、Ｔ７ＲＮＡ多聚酶和核酸酶Ｈ（ＲＮａｓｅ?Ｈ）共同协作而完成，不需特殊仪器，不需温度循环，扩增效率大于等于ＰＣＲ，其反应产物是单链ＲＮＡ。本发明专利技术的有益效果是：具有与ＲＴ－ＰＣＲ检测方法相同或更高的敏感性；重要的是由于扩增产物为ＲＮＡ，避免了ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物的污染问题；整个反应在一小时内完成；操作简单方便；反应可实时监控，也可采取终点法检测，可作为目前甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒检测的重要工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测病毒核酸的方法及试剂盒，属于生物
技术介绍
2009年3月墨西哥暴发“人感染猪流感”疫情，造成人员死亡。6月11日世界卫生 组织(以下简称WHO)宣布将流感大流行警告级别提高为最高的6级，意味着新一轮的流感 大流行的到来。研究发现，此次疫情的病原为变异后的新型甲型Hmi流感病毒，该毒株包 含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段，可以在人之间传播。WHO初始将此 次流感疫情称为“人感染猪流感”，但随着对疫情性质的深入了解，现已将其重新命名为“甲 型Hmi流感”。我国卫生部于4月30日宣布将其纳入《中华人民共和国传染病防治法》规 定的乙类传染病，依照甲类传染病采取预防、控制措施。本次发生的甲型Hmi流感是由变 异后的新型甲型Hmi流感病毒所引起的急性呼吸道传染病。通过飞沫、气溶胶、直接接触 或间接接触传播，临床主要表现为流感样症状，少数病例病情重，进展迅速，可出现病毒性 肺炎，合并呼吸衰竭、多脏器功能损伤，严重者可以导致死亡。截止2009年11月29日，我 国已报道确诊病例9. 1万余例，死亡178例。对甲型Hmi流感病人的快速诊断可以对疾病 的治疗、及时制定、实施防控措施提供指导。甲型Hmi流感病毒的检测方法包括病毒分离培养、病毒核酸检测和血清学检查 三个方面。病毒分离呼吸道标本中可分离出甲型Hmi流感病毒。合并病毒性肺炎时肺组 织中亦可分离出该病毒。然而，病毒分离方法费时、费力，无法满足疾病流行期间同时处理 大量标本的需要。血清学检查动态检测血清甲型Hmi流感病毒特异性中和抗体水平呈4 倍或4倍以上升高。但是，抗体的产生需要一至两周的时间，不能达到早期诊断的目的。目 前常用的是病毒核酸检测，以RT-PCR及real-time RT-PCR法检测呼吸道标本(咽拭子、口 腔含漱液、鼻咽或气管抽取物、痰)中的甲型Hmi流感病毒核酸，结果可呈阳性。该方法检 测灵敏度高，操作简单，但具有样品污染，假阳性率高等缺点，导致错误结果。
技术实现思路
本专利技术要解决技术问题是针对以上现有技术存在的缺点，提出一种恒温快速检 测甲型Hmi流感病毒核酸的方法及试剂盒，实现快速、准确检测甲型Hmi流感病毒的目 的。为了解决以上技术问题，本专利技术的技术方案包括以下步骤a.制备特异性检测引物，对现有核酸数据库中的所有甲型Hmi流感血凝素基因 核酸序列进行同源性对比，根据保守序列设计引物，在反向引物的5’端加入T7启动子序 列，得到特异性检测引物5， -ATTCACCATCCATCTACTAG-3，5’ -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGTCCAGTAATAGTTCATTCTC-3，；b.设计特异性检测探针，在上述特异性检测引物的内部设计分子信标探针，所述 分子信标探针的5’端用5 (6)-羧基荧光素进行荧光标记，3’端用淬灭荧光4-(4’ -恶烷氨 基苯偶氮)苯甲酸进行荧光标记，得到特异性检测探针FAM-CGCGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCKGAATCGCG-DABCYL ；c.提取样品病毒核酸；d.恒温扩增样品病毒核酸，取扩增反应液与病毒RNA混合，65士2°C温育3_5分 钟，41 士2°C温育3-5分钟，加入酶混合物，离心后迅速放回全自动荧光定量PCR检测仪， 41 士 2 °C恒温反应60-90分钟；e.用荧光检测仪读取检测结果。 本专利技术的目的通过以下技术方案进一步实现在上述步骤d中取Ilul扩增反应液 与2ul病毒RNA混合，65°C温育3_5分钟，41 °C温育3_5分钟，加入7ul的酶混合物，以4000 转/分钟离心3秒后迅速放回全自动荧光定量PCR检测仪，41°C恒温反应60-90分钟；所 述扩增反应液含有40mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸、12mM氯化镁、70mM氯化钾、5mM 二硫苏 糖醇l、lmM的脱氧三磷酸核苷酸、0. 5-2mM的三磷酸核苷酸、15 %二甲亚砜、0. 4_1 μ M的特 异性检测引物和0. 1-0. 6 μ M特异性检测探针。所述酶混合物含有4-12U的AMV逆转录酶、 20-60U的T7RNA多聚酶和0. 05-0. 2U的核酸酶H。41 °C恒温反应60分钟，每分钟采集荧光 信号一次。根据以上方法，本专利技术还提出一种恒温快速检测甲型Hmi流感病毒核酸的试剂 盒，所述试剂盒内含有Ilul扩增反应液和7ul酶混合物。其中，所述扩增反应液含有40mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸、12mM氯化镁、70mM氯 化钾、5mM 二硫苏糖醇l、lmM的脱氧三磷酸核苷酸、0. 5_2mM的三磷酸核苷酸、15 %二甲亚 砜、0. 6 μ M的特异性检测引物和0. 2 μ M特异性检测探针。所述酶混合物含有8U的AMV逆转录酶、40U的T7RNA多聚酶和0. IU的核酸酶H。本专利技术是一种快速、等温的甲型Hmi流感病毒RNA扩增方法，整个反应有赖于AMV 逆转录酶、Τ7 RNA多聚酶和核酸酶H (RNase H)共同协作而完成，不需特殊仪器，不需温度 循环，其扩增效率大于等于PCR，其反应产物是单链RNA。RNA扩增产物与荧光信号的增长呈 现对应关系。本专利技术的有益效果是具有与RT-PCR检测方法相同或更高的敏感性；重要的 是由于扩增产物为RNA，避免了 RT-PCR扩增产物的污染问题；整个反应在一小时内完成；操 作简单方便；反应可实时监控，也可采取终点法检测，可作为目前甲型Hmi流感病毒检测 的重要工具。附图说明图1为本专利技术设计的分子信标二级结构示意图；图2为检测限实验实时扩增曲线图；图3为临床标本梯度稀释实时扩增曲线图。具体实施例方式实施例一一种恒温快速检测甲型Hmi流感病毒核酸的方法，步骤如下a.制备特异性检测引物，运用生物信息学知识和相关生物信息学软件对现有核酸 数据库中能够检索到的所有甲型Hmi流感血凝素(HA)基因核酸序列进行同源性对比，根 据保守序列设计引物，在反向引物的5’端加入T7启动子序列(下划线部分)，得到特异性 检测引物，如下所示正向SWHA P25， -ATTCACCATCCATCTACTAG-3，反向SW Hl Pl5，-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGTCCAGTAATAGTTCATTCTC-3，，所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；b.设计特异性检测探针，运用生物信息学知识和相关生物信息学软件在上述特异性检测引物的内部设计分子信标探针，在分子信标探针的 5’端用5 (6)-羧基荧光素(FAM)进行荧光标记(用“R”标示)，3’端用淬灭荧光4-(4’_恶 烷氨基苯偶氮)苯甲酸(DABCYL)进行荧光标记(用“Q”标示)，同时在5’端和3’端加上 茎环序列(下划线部分)得到以下特异性检测探针FAM-CGCGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCKGAATCGCG-DABCYL ；标记的作用是在无靶标 存在的情况下，分子信标的茎环结构使得R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测 不到荧光信号。随着恒温扩增反应的进行，分子信标与完全互补的靶序列(RNA扩增产物) 形成刚性并且更加稳定的双链杂交体，使得R基团和Q基团距离增大，R基团所发出的荧光 不再为Q所吸收而被检测仪所接收。分子本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种恒温快速检测甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒核酸的方法，包括以下步骤： ａ．制备特异性检测引物，对现有核酸数据库中的所有甲型Ｈ１Ｎ１流感血凝素基因核酸序列进行同源性对比，根据保守序列设计引物，在反向引物的５’端加入Ｔ７启动子序列，得到特异性检测引物： ５’－ＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＧ－３’ ５’－ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＴＣＣＡＧＴＡＡＴＡＧＴＴＣＡＴＴＣＴＣ－３’； ｂ．设计特异性检测探针，在上述特异性检测引物的内部设计分子信标探针，所述分子信标探针的５’端用５（６）－羧基荧光素（ＦＡＭ）进行荧光标记，３’端用淬灭荧光４－（４’－恶烷氨基苯偶氮）苯甲酸（ＤＡＢＣＹＬ）进行荧光标记，得到特异性检测探针： ＦＡＭ－ＣＧＣＧＡＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＣＣＫＧＡＡＴＣＧＣＧ－ＤＡＢＣＹＬ； ｃ．提取样品病毒核酸； ｄ．恒温扩增样品病毒核酸，取扩增反应液与病毒ＲＮＡ混合，６５±２℃温育３－５分钟，４１±２℃温育３－５分钟，加入酶混合物，离心后迅速放回全自动荧光定量ＰＣＲ检测仪，４１±２℃恒温反应６０－９０分钟； ｅ．用荧光检测仪读取检测结果。...
【技术特征摘要】
一种恒温快速检测甲型H1N1流感病毒核酸的方法，包括以下步骤a.制备特异性检测引物，对现有核酸数据库中的所有甲型H1N1流感血凝素基因核酸序列进行同源性对比，根据保守序列设计引物，在反向引物的5’端加入T7启动子序列，得到特异性检测引物5’-ATTCACCATCCATCTACTAG-3’5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGTCCAGTAATAGTTCATTCTC-3’；b.设计特异性检测探针，在上述特异性检测引物的内部设计分子信标探针，所述分子信标探针的5’端用5(6)-羧基荧光素(FAM)进行荧光标记，3’端用淬灭荧光4-(4’-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸(DABCYL)进行荧光标记，得到特异性检测探针FAM-CGCGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCKGAATCGCG-DABCYL；c.提取样品病毒核酸；d.恒温扩增样品病毒核酸，取扩增反应液与病毒RNA混合，65±2℃温育3-5分钟，41±2℃温育3-5分钟，加入酶混合物，离心后迅速放回全自动荧光定量PCR检测仪，41±2℃恒温反应60-90分钟；e.用荧光检测仪读取检测结果。2.根据权利要求1所述恒温快速检测甲型Hmi流感病毒核酸的方法，其特征在于所 述步骤d中，取1 Iul扩增反应液与2ul病毒RNA混合后，65°C温育5分钟，41°C温育5分钟， 加入7ul的酶混合物，以4000转/分钟离心3秒后迅速放回全自动荧光定量PCR检测仪， 41°C恒温反应60分钟。3.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔仑标，葛以跃，史智扬，祁贤，郭喜玲，赵康辰，单军，单云峰，戚宇华，汪华，
申请(专利权)人：江苏省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。