本发明专利技术属基因工程领域，具体涉及一抑癌基因ＨＴＰＡＰ的单体型及其构建方法和应用。本发明专利技术通过对肝癌病人的ＳＮＰ检测、分析，构建了下述结构的ＨＴＰＡＰ的单体型：Ｃ－Ａ－Ｔ－Ｃ－Ａ、Ｔ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ、Ｃ－Ｇ－Ｔ－Ｃ－Ａ、Ｔ－Ａ－Ｇ－Ｇ－Ｇ、Ｃ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ａ、Ｔ－Ａ－Ｇ－Ｇ－Ａ、Ｃ－Ａ－Ｔ－Ｇ－Ａ、Ｔ－Ａ－Ｔ－Ｃ－Ａ、Ｔ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｇ、Ｃ－Ａ－Ｔ－Ｇ－Ｇ或Ｔ－Ｇ－Ｔ－Ｃ－Ｇ。本发明专利技术的单体型可以为预测肝癌术后转移复发提供指导，且简单、方便、实用；对肝癌病人预后进行评估，并对及时采取综合手段干预，提高病人远期生存率，改善预后，提供参考；可与其他分子指标相结合，为肝癌复发诊断、预后预测提供新的试制盒，方便临床应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属基因工程领域，具体涉及一抑癌基因HTPAP的单体型及其构建方法和应用。
技术介绍
现有技术公开了染色体8p缺失与肝细胞癌(h印atocellular carcinoma,以下简 称HCC)复发转移相关，并在此基础上克隆出一全长基因HTPAP。该基因是一候选肝癌 转移抑制基因，其正式名为PPAPDCIB (Phosphatidic acid pho印hatase type 2 domain containing IB),即含有IB功能域的2型磷脂酸磷酸酯酶。该基因定位于8p12，含有 7个外显子，6个内含子。基因全长4459bp， cDNA长为826bp，编码一个具有175个氨 基酸的蛋白质。该基因同源序列在动物(如黑猩猩、狗、小家鼠等)和植物(如水稻)、 从低等生物到高等生物中广泛存在，说明该基因可能有重要作用以至于在长期进化过 程中未被淘汰。已有研究发现一些人类肿瘤中该基因的异常转录表达，提示该基因具 有抑制肿瘤细胞增殖，降低侵袭性，抑制肿瘤转移的发生发展的作用。现有技术还公 开了经体内、体外研究初步证实该基因可抑制HCC的侵袭和转移，提示HTPAP基因是 一新的HCC转移抑制基因.该基因是新近发现的肿瘤相关基因，其功能研究报道目前尚 不多。单核苷酸多态性(SNP)是在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的一种DNA 序列多态性，是人类基因组中最常见的遗传变异，为第三代分子遗传标记。因为单个 SNP本身的功能有限、利用单个位点SNP分析评价HTPAP基因作用是不够全面的，它提 供的信息量也较少。已有研究发现，由于SNP之间存在连锁不平衡，位于同一条染色 体上相邻的SNP等位基因往往倾向于同时出现，并以一个整体遗传给后代。而这些位 于一条染色体特定区域的一组相互关联并倾向于以整体遗传给后代的SNP的组合即为 单体型。它决定了基因的功能单位和人群遗传变异的内在特征。单体型的存在可以极 大地减少疾病关联研究的工作量，在肿瘤侯选基因研究具有重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供肿瘤转移抑制基因HTPAP的单体型。本专利技术的进一步目的是提供上述单体型的用途。本专利技术的更进一步目的是提供含上述单体型的诊断、预后预测HCC复发的试制盒。 本专利技术可用于探讨不同的单体型与HCC的复发转移的关系，能为肝癌转移复发、 预后预测提供新的途径和分子指标。本专利技术的目的通过下述技术方案实现，采用焦磷酸测序方法(Pyrosequencing96，PSQ96)对dbSNP多态性数据库中(美 国国立生物技术信息中心Natinoal Center of Biotechnology Information, NCBI) HTPAP基因的15个SNP位点(rsl149、 rs3739252、 rs7845496、 rs4599776、 rsl0087284、 rs7007097、 rsl0099288、 rsl0102847、 rsl5103、 rs8349、 rs3215009、 rs3830326、 rs28431298、 rsl1539529、 rsl3256516)进行检测；分析每个位点序列特点，设计并 合成特定的PCR引物及测序引物，PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生 物素标记。然后将PCR产物与偶联Avidin的S印harose微珠一起孵育经碱变性分开DNA 双链后纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物特异性退火结合，PSQ 仪器即可测序反应并给出SNP测定结果。上述结果均经采用ABI-3730测序仪直接测序 相结合的方法进行验证。根据上述15个SNP的检测结果，选择有信息并最少等位基因频数(minor allele frequency, MAF)大于或等于10%的SNP进行单体型构建分析。采用Haploview version 3. 32和PHASE 2. 1分析软件(http:〃丽w. broad, mit. edu/ mpg/ haploview /PHASE 2.1)，分析单体型结构及其频数和连锁不平衡。本专利技术通过对864例HCC病人的肿瘤抑制基因HTPAP的目前所有的SNP位点检测， 对该基因进行单体型构建。本专利技术构建的HTPAP基因单体型包括如下11种，按SNP在染色体上的位置顺序依 次为rs7007097 (C/T) (+3528)、 rsll539529 (A/G) (+1838)、 rs3830326 (-/TAAG) (+1648)、 rsll49 (C/G) (+357)、 rs3739252 (A/G) (-1053);上述的位置顺序中的rs7007097-rsll539529_rs3830326-rsl149-rs3739252顺序 以1-2-3-4-5表示，其中rs3830326的插入TAAG基因型以G示，T示无插入，所述11 种单体型分别为C-A-T-C-A、T-G-G-G-G、C-G-T-C-A、T-A-G-G-G、C-A-G-C-A、T-A-G-G-A、 C-A-T-G-A、 T-A-T-C-A、 T-A-G-C-G、 C-A-T-G-G和T_G-T-C-G。其中以C-A-T-C-A、 T-G-G-G-G 、 C-G-T-C-A和T-A-G-G-G常见占近95X。表1是11种单体型及其具体频数。 表l<table>table see original document page 7</column></row><table>其中l-2-3-4陽5顺序代表rs7007097、 rsl1539529、 rs3830326、 rsl149、 rs3739252; 其中rs3830326的插入TAAG基因型以G示，T示无插入。 本专利技术的基因单体型通过下述方法和步骤构建 1、选择病人对2005年4月至2006年10月间在复旦大学肝癌研究所进行肝切除手术的864例 HCC病人进行研究，病人选择标准为手术切除；无肝外或远处转移；术前未行介入、 放疗、无水酒精注射(PEIT)等，其中男性769例，女性95例，平均年龄50.3岁(29 85岁)。表2是864例HCC临床病理特征。表2<table>table see original document page 7</column></row><table>血清AFP>20ng/L570 (66%)< 20ng/L294 (34%)肿瘤直径55 cm527 (61%)> 5cm337 (39%)肿瘤分化I级78 (9%)II级467 (54%)in或iv级319 (37%)肿瘤数目单个557 (64.5%)308 (35.5%)脉管癌栓有423 (49%)无441 (51%)2 、 SNP检测采用焦磷酸测序方法(Pyrosequencing 96,PSQ 96)，对目前美国国立生物技术信 息中心(Natinoal Center of Biotechnology Information, NCBI)上已经登录的dbSNP 多态性数据库中HTPAP基因的所有15个SNP位点(rsl149、 rs37本文档来自技高网...
【技术保护点】
肿瘤转移抑制基因ＨＴＰＡＰ的单体型，其特征是所述的单体型包括下述１１种，其结构分别为：Ｃ－Ａ－Ｔ－Ｃ－Ａ、Ｔ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ、Ｃ－Ｇ－Ｔ－Ｃ－Ａ、Ｔ－Ａ－Ｇ－Ｇ－Ｇ、Ｃ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ａ、Ｔ－Ａ－Ｇ－Ｇ－Ａ、Ｃ－Ａ－Ｔ－Ｇ－Ａ、Ｔ－Ａ－Ｔ－Ｃ－Ａ、Ｔ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｇ、Ｃ－Ａ－Ｔ－Ｇ－Ｇ或Ｔ－Ｇ－Ｔ－Ｃ－Ｇ。
【技术特征摘要】
CN 2007-7-31 200710044446.41、肿瘤转移抑制基因HTPAP的单体型，其特征是所述的单体型包括下述11种，其结构分别为C-A-T-C-A、T-G-G-G-G、C-G-T-C-A、T-A-G-G-G、C-A-G-C-A、T-A-G-G-A、C-A-T-G-A、T-A-T-C-A、T-A-G-C-G、C-A-T-G-G或T-G-T-C-G。2、 按权利要求l所述的肿瘤转移抑制基因HTPAP的单体型，其特征是所述的单 体型按SNP在染色体上的位置顺序依次为rs7007097 C/T、 rsl 1539529 A/G、 rs3830326 -/TAAG 、 rsl 149 C/G 、 rs3739252 A/G ，所述的位置顺序中的 rs7007097-rsll539529-rs3830326-rsll49-rs3739252顺序分别以1-2-3-4-5表示；其 中rs3830326的插入TAAG基因型以G示，T示无插入。3、 按权利要求1所述的肿瘤转移抑制基因HTPAP的单体型，其特征是所述的单 体型其中C-A-T-C-A、 T-G-G-G-G 、 C-G...
【专利技术属性】
技术研发人员：任宁，钦伦秀，汤钊猷，叶青海，武金才，贾户亮，孙海晶，周海军，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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