一种检测恩诺沙星药物残留的胶体金试纸卡制造技术

本发明专利技术提供了一种检测恩诺沙星药物的胶体金免疫试纸卡，包括反应膜、样本垫、结合物释放垫、吸水垫和背衬，在所述反应膜上具有包被有恩诺沙星药物－载体蛋白偶联物的测试区和包被有羊抗鼠ＩｇＧ的质控区，所述结合物释放垫包被有恩诺沙星药物单克隆抗体－胶体金标记物。本发明专利技术还提供了一种应用上述试纸卡检测恩诺沙星药物的方法，它包括步骤：首先进行样本前处理，然后用试纸卡进行检测，最后分析检测结果。本发明专利技术提供的试纸卡可用于检测动物源性食品如猪肉、猪肝、鸡肉、鸡肝、血清、鱼、虾中的恩诺沙星药物残留量，其操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低，能够现场监控，满足大量样本筛查的需要。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及兽药残留的免疫化学速测
，更具体地涉及一 种检测恩诺沙星药物残留的胶体金试纸卡，借助胶体金标记显色的免 疫层析反应，快速检测恩诺沙星药物残留。
技术介绍
恩诺沙星(enrofloxaicn， ENR)药物是近20年来迅速发展起来 的一类十分重要的广谱抗生素。在化学结构上，本类药物属于吡酮酸 衍生物(pyridonecarboxylic acids, PC As )。抑制细菌DNA螺旋酶，抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透能力强，抗菌作用是磺胺类的近千 倍，可与第三代头孢抗生素相媲美。因化学结构，价格低廉，故在医 学上和兽医学中很快取得广泛应用。在兽医临诊和水产养殖中最重要 的抗感染药物之一，但由于其耐药性和潜在的致癌性引起广泛的关 注。目前恩诺沙星药物残留常用的检测方法有两种。 一种是色谱分 析，如高效液相色谱法(HPLC)，由于复杂的仪器设备和繁瑣的过程， 不适合现场监控和大量样本筛查。另一种为免疫学方法，如酶联免疫 吸附法(ELISA)，它的缺点是检测时间长，费用较高，不利于在基 层单位推广使用。而且，这两种方法都需要专业技术人员进行操作。胶体金免疫层析(gold-immunochromatography assay, GIGA)是 将胶体金作为示踪物应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标金技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种敏感度高、操作简单、成本低的恩诺 沙星药物残留快速检测试纸卡。本专利技术的试纸卡包括反应膜、样本垫、结合物释放垫、吸水垫和背衬，在上述反应膜具有包被有恩诺沙星药物-载体蛋白偶联物的测 试区和包被有羊抗鼠IgG的质控区，所述结合物释放垫包被有恩诺沙 星药物单克隆抗体-胶体金标记物。与常规试纸卡不同的是，本专利技术试纸卡的结合物释放垫并非完全 覆盖在样本垫的下面，而是部分覆盖在样本垫的下面。这样做的好处 是可以延长检测结果观察时间，样品垫也可以将检测液体充分吸收与 金标抗体完全接触充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效 的减少误差。还可以防止检测样本中 一 些干扰成份使金标抗体中的蛋 白失去活性，影响金标抗体与包被原的结合。本专利技术将恩诺沙星-载体蛋白偶联抗原固化于反应膜测试区内， 并用胶体金标记恩诺沙星单克隆抗体，通过待测样本中的恩诺沙星药 物和包被在反应膜上的恩诺沙星-载体蛋白偶联物共同竞争恩诺沙星 单克隆抗体-胶体金标记物，根据测试区条颜色深浅或有无红色条带 来判断待测样本液中是否含有恩诺沙星残留。检测时，样本溶液滴入试剂卡孔内，当恩诺沙星在样本中浓度低于40ng/ml时，胶体金抗体 在层析过程中会被固定在反应膜上的恩诺沙星的偶联物结合，在测试 区(T)和质控区(C)内各出现一条红色条带。如果恩诺沙星在样 本中浓度高于40ng/ml时，胶体金抗体与样本中的恩诺沙星全部结合， 从而在(T)区内因为竟争反应不与恩诺沙星偶联物结合而不出现红色 条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗体抗原竟争反应，将会在(T) 区与(C)区内出现红色条带。如图2所示。阳性当(C)区显示出红色条带，而(T)区不显色，判为阳 性，表示恩诺沙星含量超过40ng/ml，用+表示。阴性当(C)区显示出红色条带，(T)区同时显示出红色条带， 且(T)带颜色接近或浅于(C)带时，判为阴性，表示恩诺沙星含 量小于40ng/ml，用-表示。无效当(C)区不显示出红色条带，则无论(T)区显示出红5色条带与否，该试纸卡判为无效。本专利技术还提供了制备上述试纸卡的方法，其包括步骤1) 制备包被恩诺沙星药物单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；2) 制备具有包被恩诺沙星药物-载体蛋白偶联物的测试区和包被 羊抗鼠IgG的质控区的反应膜；3) 将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样本垫、吸水 垫和背衬组装成试纸卡。具体地说，其步骤包括(1) 将恩诺沙星与载体蛋白偶联，形成恩诺沙星-载体蛋白偶联物；(2) 用恩诺沙星-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和 小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌恩诺沙星单克隆抗体的杂 交瘤细胞株；(3 )提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠IgG抗体；(4) 用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；(5) 将制备的恩诺沙星单克隆抗体加入制备的胶体金中，得到 恩诺沙星单克隆抗体-胶体金标记物；(6 )将结合物释放垫用含0.1 0.5%酪蛋白的磷酸氢二钾和辚酸 二氢钾混合缓冲液浸泡30秒，在37'C烘2h，然后将恩诺沙星单克隆 抗体-胶体金标记物包被在结合物释放垫上；(7) 将恩诺沙星-人血清白蛋白偶联物包被在反应膜上构成测试 区，并将羊抗鼠IgG包被在反应膜上构成质控区，用含0.5%脱脂奶 粉的封闭液进行封闭；(8) 将样本垫用含0.05 0.1%人清蛋白、0.5~1%吐温-50的磷酸 氢二钾和磷酸二氢钾混合缓冲液浸泡2h,在37X:烘2h;(9) 在背衬上按顺序贴上反应膜、吸水垫、结合物释放垫和样6本垫，将样本垫盖住结合物释放垫。最后切成3mm宽的小条，加塑 料盒，真空包装。将样本垫盖住结合物释放垫可以延长检测结果观察 时间，可使样本垫将检测液体充分吸收并与金标抗体充分反应，从而 减少误差。本专利技术试纸卡具有灵敏度高、操作简单、检测时间短、储存简单、 保质期长成本低等优点，能够现场监控，适合大量样本筛查。附图说明图i为本专利技术检测试纸卡的组装示意图； 图2为本专利技术的检测结果分析示意图。图中1、样本垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫； 5、测试区；6、质控区；7、背衬。具体实施例方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。另外，本领域的 技术人员在所附权利要求书限定的范围内可能会对本专利技术进行各种 改动或修饰，这些改动或修饰同样应落入专利技术的保护范围。实施例1 恩诺沙星检测试纸卡的制备1、恩诺沙星-载体蛋白偶联物的合成与鉴定(1) 恩诺沙星-人血清蛋白偶联物的合成30mg恩诺沙星用lml二甲基甲酰溶解。冷却至10度，加40ul 氯甲酸异丁酯，IO度搅拌反应30分钟。120mgHSA用2ml 5Ommol/L Na2C02溶解。10度反应4小时(必要时加NaOH,维持溶液的pH 为9.0),然后4度过夜。冷冻干燥，-20°。保存。(2) 恩诺沙星-牛血清蛋白的合成取EDC100mg,用pH8.0的1Ommol/LPBS液1.5mL使之充分溶 解(I液)。取恩诺沙星40mg,用0.2mol/LNaOH溶液2ml溶液溶 解(II液)。取BSA100mg，溶于3mll0mmol/LPBS (pH8.0)液中(in液)。将II液与m液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液(余下0.5ml )。 室温下避光搅拌l小时，逐滴加入余下的I液。4度搅拌12小时。 静置10小时(4度)。用蒸馏水使之充分透析(约48小时)，冷冻干 燥，-2(TC保存。(3)恩诺沙星-载体蛋白偶联物的鉴定将载体蛋白恩诺沙星药物半抗原、恩诺沙星药物-载体蛋白偶 联物用pH 7.4 PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH9 PBS调零，用紫外分光光度计在200- 800 nm波长进行扫描，得到载体蛋 白恩诺沙星药物、恩诺沙星药物-载体蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测恩诺沙星药物的胶体金试纸卡，包括反应膜、样本垫、结合物释放垫、吸水垫和背衬，其特征在于所述反应膜上具有包被有恩诺沙星药物－载体蛋白偶联物的测试区和包被有羊抗鼠ＩｇＧ的质控区，所述结合物释放垫包被有恩诺沙星药物单克隆抗体－胶体金标记物。

【技术特征摘要】
1、一种检测恩诺沙星药物的胶体金试纸卡，包括反应膜、样本垫、结合物释放垫、吸水垫和背衬，其特征在于所述反应膜上具有包被有恩诺沙星药物-载体蛋白偶联物的测试区和包被有羊抗鼠IgG的质控区，所述结合物释放垫包被有恩诺沙星药物单克隆抗体-胶体金标记物。2、 如权利要求1所述的胶体金试纸卡，其特征在于所述恩诺沙 星药物-载体蛋白偶联物由恩诺沙星药物与载体蛋白偶联得到。3、 如权利要求1或2所述的胶体金试纸卡，其特征在于所述恩 诺沙星药物单克隆抗体-胶体金标记物中的恩诺沙星药物单克隆抗体 是以恩诺沙星药物与载体蛋白偶联得到偶联复合物作为免疫原制备 获得。4、 如权利要求1或2所述的胶体金试纸卡，其特征在于所述恩 诺沙星药物单克隆抗体-胶体金标记物中的恩诺沙星药物单克隆抗体 是由杂交瘤细胞株C-l-2 CGMCC No. 2298分泌获...

【专利技术属性】
技术研发人员：何方洋，沈建忠，万宇平，冯才伟，冯才茂，赵正苗，吴小平，朱亮，汪善良，
申请(专利权)人：北京望尔生物技术有限公司，北京望尔康泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]