本发明专利技术提供了一种诱导番茄雌核发育的培养方法，其以处于Ｅ期或Ｆ期的番茄花蕾的离体胚珠作为外植体，在愈伤组织诱导培养基上诱导产生愈伤组织，其中所述Ｅ期或Ｆ期的番茄花蕾是指萼片合抱，萼片开裂最深处至花瓣顶端的长度为０－３ｍｍ的番茄花蕾。通过该方法可获得大量愈伤组织，为研究诱导雌核发育途径获得番茄单倍体提供先决条件。进一步，本发明专利技术将愈伤组织在特定的培养基上分化成芽，最后通过生根培养获得完整植株。这为诱导雌核发育途径获得番茄单倍体的研究提供了可能性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及无性繁殖技术，具体涉及一种由番茄雌核诱导得到愈伤组织，以及进一步发育获得植株的方法。
技术介绍
番茄单倍体培养技术的建立对于番东育种、分子标记、遗传图谱构建、基因定位、基因克隆等均有极其重要的意义。诱导植物的雄核发育和雌核发育是获得单倍体的2条途径。诱导雄核发育途径包括花药和小孢子培养技术，该技术已应用于大麦、小麦、玉米、水稻、烟草、亚麻、油菜、甘蓝、茄子、西瓜等作物的育种。诱导雌核发育途径包括未授粉的子房和胚珠培养，并在小麦、水稻、烟草、大蒜、甜菜、非洲菊等作物中获得成功。番菜的单倍体培养起始于1971年，Sharp得到了栽培番茶花药的愈伤组织。Gresshoff和Doy(1972)培养番茄花药获得了植株，同年Sharp创造了番茄花粉的滋养培养技术。随后众多研究者进行了番茶花药和小孢子培养研究，但普遍存在着愈伤组织诱导率低，成苗难的问题，获得了少量的花药植株，而小孢子培养仅至球形胚和类心形胚阶段，尚未得到进一步的结果(Debergh和Nitsch ( 1973 ); Devreux等(1976 ); Debergh ( 1978 ); Cappadocia(1980);高秀云、王纪方等(1979, 1980); Gulshan等(1981;Krueget-Lebus等(1983 ); Shamina和Yadav( 1986 ); Evans和Morrison(1989);袁亦楠(1999))。因此，本申请专利技术人考虑进一步探索另一条获得番茄单倍体的途径__诱导雌核发育。关于番茄雌核发育的研究较少，Ugur和Bal Kazim Abak ( 2003 )进行了番茄的子房培养，未获得愈伤组织，在培养过程中子房逐渐枯萎最后死亡。
技术实现思路
4本专利技术的目的在于提供一种番茄雌核培养方法，为番东雌核诱导愈伤以及随后育成植株提供可能。本专利技术方法是以处于E期或F期的番痴花蕾的离体胚珠作为外植体，在愈伤组织诱导培养基上诱导产生愈伤组织，其中所述E期或F期的番茄花蕾是指萼片合抱，萼片开裂最深处至花瓣顶端的长度为0-3 mm的番茶花蕾。其中所述愈伤组织培养基为优选为含有适当生长素和细胞分裂素的B5培养基。可用的生长素及细胞分裂素包括2,4-D、6-BA、NAA、IBA、 KT、 TDZ的浓度范围为0.1(imol丄"-500^imol丄"。优选培养基包括B5+ 2.0(xmol丄'1 2，4國D+1.0 (imol丄—^-BA;B5+2mg丄"2，4國D+1.0 nmol丄"6-BA + 5.0 pmoLI/1 NAA+1.0pmol丄-1 IBA+1.0 (xmol丄"KT;B5+2.0 iamol丄'1 2,4-D+1.0 iimoLL—1 6-BA + 2.0 fxmol丄—1 NAA +1.0nmol丄"TDZ。上述培养基的蔗糖浓度优选为1-3%,琼脂糖浓度为0.6-1%, pH5.8。更优选为2%，琼脂糖浓度为0.8%, pH5.8。在上述培养基上按照常规植物愈伤组织诱导培养即可，优选的培养条件是完全黑暗培养，温度28。C,湿度70%。按照上述方法进行对番茄雌核进行培养，结果表明处于E和F期的胚珠在培养8 12 h后就开始分裂生长，能够分化成愈伤组织的胚珠数目可达60%以上。本专利技术还进一步将上述愈伤组织在分化培养基上培育成植株。可用的生长素及细胞分裂素包括2，4-D、 6-BA、 NAA、 IBA、 KT、 TDZ的浓度范围为(UnmoLlZ-SOO^imoLlA优选的分化培养基包括(1) B5 + NAA 0.02 mg丄-1 + ZT 1.0 mg丄-1;(2 ) B5 + NAA 0.5 pmol丄-1 + ZT 10.0 |jmoLL-1;5(3 ) B5 + NAA 4.mg丄-1 + 2，4-D l.mg丄-1 + KT 0.8 mg丄-1 ;(4 ) B5 + IAA 0.01 mg丄-1 + ZT 2.0 mg丄-1 ;(5 ) MS + IAA 0.2 mg丄-1 + 2 mg丄-1 6國BA;(6 ) DBMII + NAA 0.5(imol.L-1+ ZT 10 jimol丄-1。上述培养基的蔗糖浓度优选1-3%，琼脂糖浓度为0.6-1%， pH5.8-6.0。更优选为2%，琼脂糖浓度为0.8%， ph5.8。在上述培养基上按照常规的分化培养条件培养即可，优选的分化培养的条件是，1611光照(90^111101'11^8-1)， 8h小时黑暗，温度28。C，湿度70%，每20-40d更换l次培养基。经上述分化培养过程中，多数愈伤组织为绿色，表现正常，少数愈伤组织可长成4cM大小的"果实"，最后成熟，"果实"表面不如正常番茄光滑，中空，内部没有种子或类似于种子的痕迹，但有番茄的"味道"。在B5 + IAA 0.01 mg丄"+ ZT 2.0 mg丄"培养基中培养的愈伤组织能够分化成芽，再经生根培养即可获得完整植株。生根培养可按照常规方法进行，优选当芽生长至2-3片叶时，将其转移至生根培养基MS + 0.2 mg丄"IAA + 2%蔗糖+ 0.8%琼脂，ph5.8中培养，l周后根即长成。本专利技术番茄雌核培养方法，釆用E期或F期的番茄大孢子的离体胚珠作为外植体，进行培养，可获得大量愈伤组织，为研究雌核发育途径获得番茄单倍体提供有先决条件。进一步，本专利技术还提供了分化培养方法，结果表明，在本专利技术提供的分化培养基上进行培养多数愈伤组织为绿色，表现正常，少数愈伤组织可长成4cM大小的"果实"，最后成熟，"果实"表面不如正常番茄光滑，中空，内部没有种子或类似于种子的痕迹，但有番东的"味道"。在特定的培养基上进行培养还能分化成芽。进一步，通过生根培养可获得完整植株。这为雌核发育途径获得番茄单倍体的研究提供了可能性。附图说明图1所示的是番茄花蕾发育的不同时期； 图2所示的是培养3周后E、 F型的膨大子房； 图3所示的是在离心管中培养1周后的胚珠，右图为左图其中一 管在200倍下的照片；图4是分别生长在离心管和三角瓶中的愈伤组织； 图5是由胚珠发育而来的"果实"； 图6是愈伤组织分化形成的芽点； 图7是愈伤组织分化形成的芽； 图8是再生植株。具体实施例方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的 限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或 条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段。实施例l愈伤组织诱导培养l材料与方法1.1材料试材为中国农业科学院蔬菜花丼研究所育成的两个杂交番茄品种'中杂ior和'中杂i05，(购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所)，2006-2008年种植于春季温室、春季大棚、露地、秋季大 棚和秋季温室，以保证周年釆集样本，每种材料每次种植40 - 100株， 均按常规方法管理，植株定植1周后选取合适的花蕾进行子房和胚珠 分离。1.2诱导培养基的筛选共选用了 20种诱导培养基，其成分以 B5和MS (均购自Sigma公司)为基本培养基，附加不同浓度(1-lOOpmol丄-1)的生长素(IA、 NAA、 2,4-D、 IBA)和细胞分裂素(KT、76BA、 TDZ、 ZT)本文档来自技高网...
【技术保护点】
番茄雌核发育培养方法，其以处于Ｅ期或Ｆ期的番茄花蕾的离体胚珠作为外植体，在愈伤组织诱导培养基上诱导产生愈伤组织，其中所述Ｅ期或Ｆ期的番茄花蕾是指萼片合抱，萼片开裂最深处至花瓣顶端的长度为０－３ｍｍ的番茄花蕾。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王孝宣，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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