雌核发育鲤鱼的培育方法技术

本发明专利技术涉及雌核发育鱼的培育，具体公开了一种雌核发育鲤鱼的培育方法，其步骤为：以雄性团头鲂和雌性普通鲤鱼作为父、母本亲鱼进行人工催产，然后将经过紫外线灭活的团头鲂精子与普通鲤鱼的成熟卵子混合，经１ｍｉｎ～２ｍｉｎ激活后，将被激活的卵子置于０℃～４℃温度条件下冷休克处理３０ｍｉｎ～４０ｍｉｎ，再将冷休克处理后得到的胚胎置于２０℃～２１℃水温下孵化，获得二倍体雌核发育鲤鱼。本发明专利技术方法培育的雌核发育鲤鱼后代性状优良、存活率高、遗传稳定，对生物学遗传育种研究具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种鱼类的培育方法，尤其涉及一种雌核发育鱼的培育方法。
技术介绍
人工雌核发育技术被用于快速构建鱼类纯系，有非常明显的效果；同时，在鱼 类性别决定、基因图谱的建立等领域也有着重要的意义和价值。一般雌核发育鱼的培育 是采用鱼类单倍体卵子经遗传物质灭活的精子激活，再经过染色体的加倍处理，形成主 要依靠卵子的遗传物质来发育的二倍体后代。用来激活卵子的精子，一般是异源精子， 虽然经过灭活处理，但是存在“异精效应”。这种“异精效应”对雌核发育后代可能产 生遗传改良的作用。另外，利用冷休克的方法进行雌核发育，使卵子经历了冷休克的过 程，该过程能够淘汰体质弱胚胎，而筛选出具有生命力强的存活后代。鲤鱼(CyprinuscarpioL.，2n = 100)属于鲤科、鲤亚科、鲤属，是我国淡水鱼类 中品种最多、分布最广、产量最高的鱼类之一。团头鲂(Megalobrama amblycephala，2n =48)属于鲤科、舶亚科，其生长速度快，肉质细嫩。如何利用团头鲂使鲤鱼在体型和 肉质方面得到改良，并且保证较高的存活率，是值得我们研究的问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种后代性状优良、存 活率高、遗传稳定、对生物学遗传育种研究具有重要意义的。为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为一种雌核发育鲤鱼的培育方 法，其步骤为以雄性团头鲂和雌性普通鲤鱼作为父、母本亲鱼进行人工催产，然后将 经过紫外线灭活的团头鲂精子与普通鲤鱼的成熟卵子混合，经lmin 2min激活后，将被 激活的卵子置于0°C 4°C温度条件下冷休克处理30min 40min，再将冷休克处理后得 到的胚胎置于20°C 21°C水温下孵化，获得二倍体雌核发育鲤鱼。上述的中，所述人工催产的具体方法优选为在繁殖 季节，对所述用作父、母亲鱼的团头鲂和普通鲤鱼进行注射，先对所述普通鲤鱼注射绒 毛膜促性腺激素和促黄体素释放激素类似物，绒毛膜促性腺激素的用量为800IU/kg 1000IU/kg,促黄体素释放激素类似物的用量为20 u g/kg 30 i! g/kg ； 3h 4h后再对所 述团头鲂注射绒毛膜促性腺激素和促黄体素释放激素类似物，注射剂量相比普通鲤鱼减 半；注射后按1 (1 1.5)的数量比将所述父、母亲鱼放入同一产卵池中进行催产。上述的中，所述紫外线灭活的具体方法优选为先对 所述人工催产后的团头鲂进行挤压，挤出的团头鲂精子用Hank’ s液按1 4的体积比稀 释，然后以薄层形式平铺在4°C预冷的培养皿中，然后将培养皿置于垫有冰袋的摇床上， 并用紫外灯在距离10cm 12cm处进行照射处理；在照射15min后，每隔2min沾取少量 精液涂于载玻片上，用水激活，于显微镜下镜检判断其活性，当90%的精子只能原地转 圈时停止照射，得到紫外线灭活的团头鲂精子。该优选的紫外线灭活的具体方法中，所述 Hank，s 液的配方优选为KC10.40g、NaCl 8.00g、NaHCO3 0.35g、KH2PO4 0.06g、 Na2HPO4 · 7H20 0.09g、Na2HPO4 · 12H200.10g、MgSO4 · 7H20 0.10g、MgCl2 · 6H20 0.10g、CaCl2 0.14g、Glucose 1.OOg ；加蒸馏水配至 1L。本发 明创新性地选用团头鲂精子作为刺激源通过冷休克处理来人工诱导雌核发 育鲤鱼，因为团头鲂具有体背高、肉质好的特点，通过团头鲂的“异精效应”可以使得 雌核发育鲤鱼在体背、肉质等方面得到遗传改良；通过冷休克处理，可以筛选到生命力 强的雌核发育鲤鱼，达到提纯复壮的目的。另外，根据鲤鱼卵子质量发育较好的特点， 本专利技术适当延长冷休克处理的时间，提高了染色体加倍的效率，从而也提高了雌核发育 鲤鱼的存活率。同时，本专利技术中二倍体雌核发育鱼较易与远缘杂交后代及单倍体后代在 外形、染色体等方面区分开来，有利于筛选出二倍体雌核发育鲤鱼。与现有技术相比，本专利技术的优点在于本专利技术获得的雌核发育鲤鱼不仅肉质得 到改良、体背增高，而且在鱼类遗传育种和生物进化方面具有重要意义。本专利技术方法用 与鲤鱼亲缘关系较远的团头鲂精子诱导鲤鱼卵子进行雌核发育，显著提高了人工雌核发 育的成功率和雌核发育后代的鉴定效率，表明用亲缘关系较远的灭活精子作为诱导源能 显著提高人工雌核发育鱼的存活率，获得的大量雌核发育鲤鱼。此外，本专利技术的培育方 法在生物进化研究和鱼类遗传育种方面也具有重要的生物学意义。附图说明图1为本专利技术具体实施方式中母本鲤鱼、父本团头鲂精子及正常形态雌核发育 鲤鱼苗的DNA含量峰值分析图；在该图中，X轴代表DNA含量的数量级，y轴代表测定 的细胞数，每一峰值代表一群DNA含量相同的细胞，其中的A图表示母本鲤鱼的DNA 含量峰值分析图；B图为刺激源团头鲂精子的DNA含量峰值分析图；C图为正常形态雌 核发育鲤鱼苗的DNA含量峰值分析图。图2为本专利技术具体实施方式中制备的雌核发育鲤鱼成鱼的外形图。图3为本专利技术具体实施方式中雌核发育鲤鱼染色体数目及性腺结构比较图；其 中，A图为雌核发育鲤鱼染色体中期分裂相(2η = 100) ； B图为雌核发育鲤鱼的性腺结 构(正常II期卵巢)。图4为本专利技术具体实施方式中微卫星引物MFW4扩增的普通鲤鱼、雌核发育鲤 鱼图谱；其中A图为普通鲤鱼的电泳图谱，B图为雌核发育鲤鱼的电泳图谱；第一泳道 为 pBR322 marker。具体实施例方式以下结合说明书附图和具体实施方式对本专利技术作进一步描述。一种本专利技术的，具体包括以下步骤1.在繁殖期前2 3个月挑选性成熟特征明显、体型好、体色鲜艳、体质健壮、 无病无伤的雌性鲤鱼和雄性团头鲂个体作为亲鱼进行专池精养，合理投喂饲料，促进亲 鱼性腺良好发育。2.到了繁殖季节，挑选体征良好、性腺发育成熟的上述亲鱼注射绒毛膜促性腺 激素(HCG)与黄体素释放激素类似物(LRHA)的混合液，以进行人工催产。先注射雌性鲤鱼，注射雌性鲤鱼时HCG的用量为800IU/kg 1000IU/kg、LRH-A的用量为20 u g/ kg 30 y g/kg ； 3h 4h后再注射雄性团头鲂，剂量减半；注射后按1 (1 1.5)的 数量比将雌雄鱼放入同一圆形产卵池中，水面吊一纱窗网片，以检测亲鱼的发情产卵情 况；注射时均采用胸鳍基部凹陷无鳞处腹腔一次性注射的方法，以减少实验操作对亲鱼 的损害，提高亲鱼的产后存活率。当发现亲鱼在产卵池中呈“螺旋状”追逐、且纱窗网 片上沾有适量卵粒后，开始拉网打捞亲鱼并进行检测(注意要用软质网，操作要轻，水 中检测)；按一对一配对原则挑选2 3组催产效果良好的亲鱼进行后续的雌核发育鲤鱼 的诱导培育。3.对上述挑选出的亲鱼进行人工干法授精，先将挤出的团头鲂精子用Hank’ s 液按1 4的体积比稀释，以1mm薄层分布在培养皿中，然后将培养皿置于垫有冰袋的 摇床上，并用紫外灯在距离10cm 12cm处照射处理28min 32min (视精子活力情况而 定)。在照射15min后，每隔2min用牙签沾取少量精液于载玻片上，用水激活，于显微 镜下镜检判断其活性，当90%的精子只能原地转圈，活力明显丧失时停止照射。马上将 灭活的精子与雌性鲤鱼的成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种雌核发育鲤鱼的培育方法，其步骤为：以雄性团头鲂和雌性普通鲤鱼作为父、母本亲鱼进行人工催产，然后将经过紫外线灭活的团头鲂精子与普通鲤鱼的成熟卵子混合，经１ｍｉｎ～２ｍｉｎ激活后，将被激活的卵子置于０℃～４℃温度条件下冷休克处理３０ｍｉｎ～４０ｍｉｎ，再将冷休克处理后得到的胚胎置于２０℃～２１℃水温下孵化，获得二倍体雌核发育鲤鱼。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘少军，刘筠，邹拓谜，肖俊，肖军，赵如榕，罗凯坤，陶敏，张纯，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：43