一种促进甘蓝游离小孢子胚胎发生的方法技术

本发明专利技术公开了一种促进甘蓝游离小孢子胚胎发生的方法，该方法是在含有３ｍＬ?ＮＬＮ－１３悬浮小孢子的培养皿中直接添加秋水仙素生物碱和噻二唑苯基脲（ＴＤＺ）细胞分裂素诱导胚状体发生。具体包括下列步骤：１）分别配制秋水仙素和ＴＤＺ母液的步骤；２）分别对秋水仙素母液和ＴＤＺ母液的灭菌步骤；３）花蕾选取与消毒步骤；４）小孢子游离与纯化步骤；５）诱导胚状体步骤。该方法对常规培养无反应的甘蓝材料，能促使其出胚，对出胚的甘蓝材料，能提高其胚状体产量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物遗传育种
，具体涉及一种促进甘蓝游离小孢子胚胎发生 的方法。
技术介绍
植物界游离小孢子培养是直接从花蕾获取游离态的小孢子群体进行培养诱导其 胚胎发生形成单倍体(Haploid)，进而加倍形成双单倍体(DoubleHaploid)植株的过程，这 种双单倍体植株的自交后代则是DH系。自Lichter于1982年首次从油菜小孢子培养物中 获得小孢子植株以来，许多重要作物如小麦、玉米、油菜、大白菜等利用小孢子培养都获得 了小孢子植株或在实际工作中得到有效利用。甘蓝是结球甘蓝(Brasscia oleracea var. capitata)的简称，是十字花科芸薹属一种重要的蔬菜作物，异花授粉；在甘蓝作物上进行 的小孢子培养研究已有报道，但是因其出胚较其它作物困难，即多数材料对常规培养无反 应或出胚材料产胚量很低，成为目前这项技术有效利用的最大障碍。秋水仙素(C22H25NO6) 是一种水溶性生物碱，它除具有染色体加倍作用外，还能够促进游离小孢子胚状体的形成； 人们已添加秋水仙素用于甘蓝型油菜、白菜型油菜、小麦等作物小孢子培养研究中，起到了 诱发小孢子胚胎发生作用。但甘蓝是植物界很难诱导出小孢子胚状体的一种作物，在我们 研究中添加了秋水仙素诱发小孢子胚胎发生，也起到了一定的作用，但其诱导出胚效果不 理想。基于这种原因拟想探索出一种在添加秋水仙素的同时，再添加一种细胞分裂素(噻 二唑苯基脲(TD^Q^KOS)的方法来提高小孢子胚胎发生率，结果获得了显著的效果。这 一种方法对常规培养无反应的甘蓝材料，能促使其出胚，对出胚的甘蓝材料，能提高其胚状 体产量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了。该方法对常 规培养无反应的甘蓝材料，能促使其出胚；对出胚的甘蓝材料，能提高其胚状体产量。实现上述专利技术目的的技术方案是，具 体包括下列步骤1)分别配制秋水仙素和TDZ母液的步骤；2)分别对秋水仙素母液和TDZ母液的灭菌步骤；3)花蕾选取与消毒步骤；4)小孢子游离与纯化步骤；5)诱导胚状体步骤。所述的秋水仙素和TDZ母液配制包括下列步骤1)秋水仙素母液配制①称取秋水仙素3克；②在秋水仙素中滴入少许酒精导溶后再加适量蒸馏水振摇使其全部溶解；③在秋水仙素溶液中继续用蒸馏水定容至lOOOmL，即得浓度为3g/L的秋水仙素 母液；2)TDZ母液的配制①称取TDZ0.3 克；②将称取的TDZ放进lOOmL的小烧杯中，滴入少许lmol/L的NaOH溶液导溶后加 适量蒸馏水振摇使其全部溶解；③将全部溶解后的TDZ定溶到1000mL定量瓶中，即配成0. 3g/L的母液。所述的秋水仙素母液的抽滤灭菌包括下列步骤1)用抽滤器将秋水仙素母液先用0. 45 y m滤膜预抽滤一遍；2)将灭过菌的抽滤器主要部件安装和放置在超净工作台上，并用镊子将灭过菌的 0. 22um滤膜放到滤头位置安装好；将预抽滤的秋水仙素母液在无菌超净工作台上抽滤一 遍，装入贮藏瓶4°C冰箱中保存，待具体使用时再按所需要浓度进行稀释。所述的TDZ母液的高压灭菌包括下列步骤1)将TDZ母液装入耐压瓶，封口放入高压灭菌锅；2)在1. 5压力下灭菌30分钟，随后冷却放在4°C冰箱中保存，待具体使用时再按 所需要浓度进行稀释。所述的花蕾选取与消毒包括下列步骤1)在盛花前期，采集长度3. 5 5. 5mm的花蕾在室内用倒置显微镜确定单核晚期 至双核早期的花蕾长度，以此为标准选取一定数量的花蕾供试；2)将供试花蕾用体积分数70%酒精浸泡30s，再用10g/L升汞浸泡lOmin，最后用 无菌蒸馏水漂洗3次，每次lmin。所述的小孢子游离与纯化包括下列步骤1)将已消毒的花蕾放入无菌试管中，以含蔗糖130g/L的B5培养基为洗涤剂，用玻 璃棒挤压花蕾使小孢子游离出来；2)用孔径50 iim无菌网过滤，收集滤液于离心管中，离心3次，沉在离心管底部的 即为纯净小孢子。所述的诱导胚状体包括下列步骤1)用微量移液器分别吸取一定量的秋水仙素母液和TDZ母液直接添加于含有3mL NLN-13悬浮小孢子的培养皿中，使秋水仙素浓度在0. 1 50mg/L之间，TDZ浓度在0. 01 0. 2mg/L 之间，封口 ；2)将培养皿静置在32°C下黑暗培养48h ；3)将培养皿内含小孢子的培养基装入离心管置于离心机中，在2000r/min的速度 下离心三次，第一次离心lOmin，弃去上清液；第二次再向离心管内加入10ml NLN-13悬浮 液培养基，继续离心lOmin，弃去上清液；第三次再向离心管内加入10ml NLN-13悬浮液培 养基，继续离心5min，弃去上清液；然后将小孢子悬浮培养在不含有秋水仙素和TDZ的新鲜 6mL NLN-13培养基中，培养于培养皿中，封口 ；4)将悬浮小孢子的培养皿静置于25°C、黑暗条件下继续培养，直到肉眼可见小白 点时，改换为振荡培养；5)将肉眼可见小白点的培养皿转至60r/min振荡培养，同时保持适当的弱光条件，继续培养直至胚状体发育完全。所述的盛花前期是指第一侧枝始花至第三侧枝始花期间。所述的离心3次条件为以含蔗糖130g/L的B5培养基为洗涤剂，每次5min，2000r/mirio所述的NLN-13为含130g/L蔗糖的NLN培养基。与现有技术相比，本专利技术的方法具有以下优点1、对常规培养无反应的甘蓝材料，能诱导其部分材料出胚，其出胚材料占供试材 料52. 6%，平均产胚量1. 05胚/蕾 6. 57胚/蕾，较单一添加10mg/L秋水仙素提高幅度 0. 85胚/蕾 6. 60胚/蕾，较单一添加0. lmg/LTDZ提高幅度1. 0胚/蕾 6. 67胚/蕾。2、对常规培养有反应出胚的甘蓝材料，均能够提高其胚状体产量，每蕾产胚量 较未添加秋水仙素和TDZ提高幅度21. 8 % 550. 0 % ；较单一添加秋水仙素提高幅度 7. 14%~ 376. 0% ；较单一添加 TDZ 提高幅度 17. 360. 2% 03、在诱导出的胚状体中，均能够提高子叶型胚率，其比率较未添加秋水仙素和TDZ 提高幅度6. 8% 69. ；较单一添加秋水仙素提高幅度3. 8% 66. 5% ；较单一添加TDZ 提高幅度0.8% 67. 8%。附图说明图1是甘蓝小孢子培养花蕾适宜选取植株生长时期图；图2是用倒置显微镜确定选取单核晚期至双核早期的花蕾不同长度图；图3是本专利技术的方法对甘蓝小孢子常规培养无反应材料A632M-1S-5-6-3-8诱导 产胚图；图4是本专利技术的方法对甘蓝小孢子常规培养出胚材料633MXYP03诱导产胚图；图5是子叶型胚状体图。具体实施例方式实施例11、分别配制秋水仙素和TDZ母液的步骤；1)秋水仙素母液配制①称取秋水仙素3克；②在秋水仙素中滴入少许酒精导溶后再加适量蒸馏水振摇使其全部溶解；③在秋水仙素溶液中继续用蒸馏水定溶到1000mL，即得浓度为3g/L的秋水仙素 母液；2)TDZ母液的配制①称取TDZ0. 3 克；②将称取的TDZ放进100mL的小烧杯中，滴入少许lmol/L的NaOH溶液导溶后加 适量蒸馏水振摇使其全部溶解；③将全部溶解后的TDZ定溶到1000mL定量瓶中，即配成0. 3g/L的母液。2、秋水仙素母液的抽滤灭菌包括下列步骤1)用抽滤器将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促进甘蓝游离小孢子胚胎发生的方法，其特征在于，包括下列步骤：１）分别配制秋水仙素和ＴＤＺ母液的步骤；２）分别对秋水仙素母液和ＴＤＺ母液的灭菌步骤；３）花蕾选取与消毒步骤；４）小孢子游离与纯化步骤；５）诱导胚状体步骤。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张恩慧，杨平安，许念芳，许忠民，程永安，马勇斌，王小艳，马青山，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：61[中国|陕西]