本发明专利技术提供了一种新疆雪莲组织培养丛生苗及其大规模继代培养的方法，该方法包括在ＭＳ改良培养基①上诱导形成愈伤组织；在ＭＳ改良培养基②上通过愈伤组织筛选和继代诱导出一种可迅速分化丛生苗、稳定继代的愈伤组织ＸＣＳＹ－１，该组织在壮苗培养基上可迅速分化成状态均一的丛生苗。通过对愈伤组织ＸＣＳＹ－１进行继代增殖，可大量培养出生长状态均匀的新疆雪莲丛生苗。该雪莲丛生苗可直接作为产品或原料，又可培育生根试管苗进行人工种植。该方法操作简单，可用于大规模生产，与野生型相比生产周期大大缩短，并且质量稳定，产量高。此外，该方法不占耕地，不破坏雪莲野生资源，保护了生态环境，解决了新疆雪莲资源短缺的问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及可迅速分化丛生苗、稳定、高产，可继代的新疆雪5莲愈伤组织XCSY-1及其选择方法，本专利技术还涉及一种新疆雪莲组 织培养丛生苗及其大规模继代培养的方法。
技术介绍
雪莲(Saussurea involucrata Kar. et Kir. et Maxim.)菊禾斗凤毛菊 属雪莲亚属的草本植物。雪莲是高山地区的民间药用植物，用于散 10 寒除湿、活血通经、抗炎镇痛等，民间多用于风湿性关节炎、妇女小腹冷痛、闭经，胎衣不下、麻痹不透、肺寒咳嗽、阳痿、髙山不 适应症等症的治疗。近年来，雪莲作为民族药在抗炎镇痛、抗早孕、 抗衰老及抑制癌细胞增生方面的作用倍受关注。但我国雪莲主要分布在4000m以上的高原寒带地区，如新疆、甘肃、四川、云南和西 15 藏。这些地区气候多变，冷热无常，最高月平均气温3-l(TC，最低 月平均气温则在零下十几度到几十度，生长环境十分恶劣，只有耐 寒的苔草属、蒿草属以及少数高山多年生草本植物与之伴生， 一般 在此环境下的雪莲植物大多为多年生，生长缓慢，人工栽培困难， 长期以来掠夺性采挖已使雪莲资源严重匮乏，己使得雪莲成为濒危 20 物种，自然资源难以满足临床日益增长的需要。因此应用组织培养 的方法进行雪莲的开发即可以满足临床对雪莲药物的需求，也可以 保护自然资源，维护生态环境。现有技术表明，对雪莲丛生苗的诱导与培养多为器官发生，采 用这方方法的问题是，生产雪莲丛生苗的过程中会耗费很多人力、 25物力，并且，由芽生长的雪莲丛生苗，生长状态不均一，不便于后 期的利用与开发。国内有文献报多多是对雪莲愈伤组织进行继代规模培养的报道，鲜有直接利用继承代方式直接培养雪莲丛生苗的报 道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提提供了一种新疆雪莲组织培养丛生5苗及其大规模继代培养的方法，该方法包括在MS改良培养基①上 诱导形成愈伤组织；在MS改良培养基②上通过愈伤组织筛选和继 代诱导出一种可稳定继代、芽点突出的愈伤组织XCSY-1，该组织在 壮苗培养基上可迅速分化成状态均一的丛生苗。通过对愈伤组织 XCSY-1进行继代增殖，可大量培养出生长状态均匀的新疆雪莲丛生 io苗。该雪莲丛生苗可直接作为产品或原料，又可培育生根试管苗进 行人工种植。本专利技术第二个目的在于提供一种可迅速分化雪莲丛生苗、高产、 稳定可继代的新疆雪莲愈伤组织XCSY-1，用于雪莲丛生苗的生产。 本专利技术以新疆雪莲(其种胚、根、茎、叶)作为外植体，诱导愈 15伤组织，通过与上组织诱导丛生芽，通过反复继代培养和筛选得到 高产、稳定可继代的的新疆雪莲愈伤组织XCSY-1。该新疆雪莲愈伤 组织XCSY-1具有以下特征生长旺盛、颜色呈嫩绿色或黄绿色， 结构紧凑、带有明显尖状突起组织，培养周期15-20天。 、 具体地说，本专利技术通过如下方法制备得到上述雪莲愈伤组织 20 XCSY-1:(1)新疆雪莲无菌苗的培育取天然新疆雪莲的种子，已通过中国科学院研究所标本馆(国家植物标本馆)鉴定，用75%的酒精溶液浸泡30秒，用0.1%升汞 溶液浸泡振荡灭菌10分钟，用无菌水清洗4-5次；用含有赤霉素 25 1.0mg/L_0.2 mg/L的溶液中浸泡24小时；浸泡24小时后，将种子 再次使用0.1%升荥溶液浸泡振荡灭菌10分钟，用无菌水清洗4-5 次；在无菌条件下剥去种子外壳，撕去种子内膜，将去皮种子接种在配好的植株诱导MS培养基(赤霉素1.0mg/L—0.2mg/L)上，每 40毫升培养基播种10粒种子；在25。C下，避光培养4-6天，待种 子发芽后，将培养物转移至光照条件下培养3-5天，培养成雪莲植 株。5 (2)愈伤组织的诱导和培养取无菌苗根、茎、叶及子叶、胚芽做外植体，在无菌条件下，用 无菌手术剪刀和无菌镊子将无菌苗根、茎、叶及子叶、胚芽切成 2-5mm长的小段，接种在MS改良培养基①(MS基本培养基+6-BA 0.1-0.5mg/L+NAAl-3mg/L+蔗糖3。/o+琼脂0.60/。)上，22-27。C暗培 io养，7-10天诱导出愈伤组织。(3) 诱导愈伤组织XCSY-1 将诱导形成的愈伤组织转至MS改良培养基②(MS基本培养基+6-BA2.0-4.0 mg/L+ NAAO.l-l.Omg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%)上，诱 导愈伤组织XCSY-1，继代时间15-20天，培养温度为22。C-28。C， 15光照强度为2200-27001ux，光照时间为8-12小时/天。(4) 丛生芽继代培养筛选愈伤组织XCSY-1细胞系，选取生长旺盛、颜色为嫩绿色 或黄绿色、结构紧凑、带有明显尖状突起组织特征的愈伤组织进行 周期性的继代培养。培养条件，每100mlMS改良培养基②中转接愈 20 伤组织XCSY-12g，培养周期15-20天，培养温度为22。C-28。C，光 照强度为2200-27001lix，光照时间为8-12小时/天；至培养期，选 取生长旺盛、颜色为嫩绿色或黄绿色、芽点突出特征的愈伤组织作 为种子，种子量为生产量的30%，其他转入壮苗培养基中培养丛生 苗。25 本专利技术的第三个目的在于提供上述雪莲愈伤组织XCSY-1的继代培养方法，其所用培养基为MS改良培养基②(MS基本培养基 +6-BA2.0-4.0 mg/L+ NAA O.l-l.Omg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%) pH值85.2-5.8，培养条件每100ml MS改良培养基②中转接愈伤组织 XCSY-1 2g温度22-27°C ，光照10-12小时，培养时间15 20天。本专利技术细胞系可用于雪莲丛生苗的大规模生产，不仅满足了临床 需求，而且保护了国家珍稀植物野生雪莲。5 本专利技术的优点主要体现(1)本专利技术提供一种可以迅速分化丛生苗，且可稳定继代的雪莲愈伤组织XCSY-1细胞。通过在对愈伤组织XCSY-1进行继代增 殖，从而能生产出大量的雪莲丛生苗。(2)雪莲丛生苗有效成份， 生长状态与野生雪莲相同，具有野生雪莲的有效含量。(3)通过本 io 专利技术方法可进行大规模生产，与野生型相比生产周期大大縮短，并 且所生产的培养物质量稳定产量高。(4)本专利技术方法不占耕地，不 破坏雪莲野生资源，保护了生态环境，解决了新疆雪莲资源短缺的 问题。具体实施例方式15 下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应当理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不能限制本专利技术的保护范围。实施例l雪莲愈伤组织XCSY-1的获得取天然新疆雪莲的种子，用75%的酒精溶液浸泡30秒，用0.1% 升汞溶液浸泡振荡灭菌10分钟，用无菌水清洗4-5次；用含有赤霉20 素1.0mg/L—0.2 mg/L的溶液中浸泡24小时；浸泡24小时后，将种 子再次使用0.1%升汞溶液浸泡振荡灭菌IO分钟，用无菌水清洗4-5 次；在无菌条件下剥去种子外壳，撕去种子内膜，将去皮种子接种 在配好的植株诱导MS培养基(赤霉素1.0mg/L—0.2mg/L)上，每 40毫升培养基播种10粒种子；在25'C下，避光培养4-6天，待种25 子发芽后，将培养物转移至光照条件下培养3-5天，培养成雪莲植 株。取无菌苗根、茎、叶及子叶、胚芽做外植体，在无菌条件下，用无菌手术剪刀和无菌镊子将无菌苗根、茎、叶及子叶、胚芽切成2-5mm长的小段，接种在MS改良培养基本文档来自技高网...
【技术保护点】
权利要求１所述的一种新疆雪莲组织培养丛生苗及其大规模继代培养的方法，其特征在于，采用野生新疆雪莲的种胚或由种子萌发的无菌苗为外植体，在含激素的ＭＳ（配方见附表１）改良培养基①（ＭＳ基本培养基＋６－ＢＡ０．１－０．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ１－３ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３％＋琼脂０．６％）上诱导愈伤组织；在含激素的ＭＳ（配方见附表１）改良培养基②（ＭＳ基本培养基＋６－ＢＡ２．０－４．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．１－１．０ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３％＋琼脂０．６％）上通过愈伤组织筛选和继代诱导出一种可稳定继代、芽点突出的愈伤组织ＸＣＳＹ－１；将愈伤组织ＸＣＳＹ－１转接至壮苗培养基上壮苗，形成新疆雪莲丛生苗。具体操作按下列步骤进行： ａ、植株诱导 选取成熟的雪莲种子，用７５％的酒精溶液浸泡３０秒，用０．１％升汞溶液浸泡振荡灭菌１０分钟，用 无菌水清洗４－５次；用含有赤霉素２．０－１．０ｍｇ／Ｌ的水溶液中浸泡２４小时；浸泡２４小时后，将种子再次使用０．１％升汞溶液浸泡振荡灭菌１０分钟，用无菌水清洗４－５次；在无菌条件下剥去种子外壳，撕去种子内膜，将去皮种子接种在配好的植株诱导ＭＳ培养基（ＭＳ基本培养基＋赤霉素２．０－１．０ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３％＋琼脂０．６％）上，每４０毫升培养基播种１０粒种子；在２５℃下，避光培养５天，待种子发芽后，将培养物转移至光照条件下培养４天，培养成雪莲植株； ｂ、诱导愈伤组织 取 无菌苗根、茎、叶及子叶、胚芽做外植体，在无菌条件下，用无菌手术剪刀和无菌镊子将无菌苗根、茎、叶及子叶、胚芽切成２－５ｍｍ长的小段，接种在ＭＳ改良培养基①（ＭＳ基本培养基＋６－ＢＡ０．１－０．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ１－３ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３％＋琼脂０．６％）上，２２－２７℃暗培养，７－１０天诱导出愈伤组织。 ｃ、诱导愈伤组织ＸＣＳＹ－１ 将诱导形成的愈伤组织转至ＭＳ改良培养基②（ＭＳ基本培养基＋６－ＢＡ２．０－４．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．１－１．０ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３％＋琼脂０． ６％）上，诱导愈伤组织ＸＣＳＹ－１，继代时间１５－２０天，培养温度为２２℃－２８℃，光照强度为２２００－２７００１ｕｘ，光照时间为８－１２小时／天。 ｄ、愈伤组织ＸＣＳＹ－１继代培养 选取生长旺盛、颜色为嫩绿色或黄绿色、结构紧凑 、带有明显尖状突起组织特征的愈伤组织进行周期性的继代培养。培养条件，每１００ｍｌ ＭＳ改良培养基②中转接愈伤组织ＸＣＳＹ－１２...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘汉石，
申请(专利权)人：陈梓，初颖，大连普瑞康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]
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