本发明专利技术公开了一种提高辣（甜）椒游离小孢子培养胚状体诱导率的方法，属于利用细胞遗传学理论与育种技术领域。该发明专利技术在前人已发表的辣椒游离小孢子培养获得胚状体培养方法的基础上，通过提高培养用花蕾质量，采用从花蕾的取样、前期预处理、灭菌到花药剥取全程低温控制，并于７℃黑暗预培养一周后转到２８℃黑暗培养的关键技术，使获得的胚状体最高达８．４个胚状体／花药，平均为１．３个胚状体／花药，高于公布的１个胚状体／花药的专利技术及国内目前报道的最高为１．８３个胚状体／花药的研究。本发明专利技术的特点是：方法实用、步骤具体、适用的基因型广泛、重复性好，可实现辣（甜）椒游离小孢子培养在单倍体育种及创建遗传作图群体上的广泛应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于利用 细胞遗传学理论与育种
技术介绍
在辣(甜)椒育种工作中，自交系的选育是非常重要的工作，但常规选育方法存在 周期长、费用高、占地多等问题。单倍体育种是解决这一问题的重要方法，它可以大大提高 育种效率，缩小育种群体的规模，并缩短育种年限。游离小孢子培养是获得单倍体的主要途 径。经小孢子培养得到的花粉株系间性状变异幅度大，超亲现象和出现特殊优良性状的频 率要显著高于常规育种；株系内性状整齐，世代间稳定性强；通过小孢子培养获得的自交 系具有高度的纯合性，杂交配组可获得更强的杂种优势；通过该法建立起来的DH群体是开 展ALFP、RAPD、SSR等分子标记和基因图谱研究用的理想材料。因此，游离小孢子培养技术 在遗传和育种研究中具有十分重要的应用价值。辣(甜)椒游离小孢子培养获得胚状体技术在国内外已有成功的研究报道，张 菊平等获得了专利(专利号ZL 200610042616.0)，但目前国内报道显示，辣(甜)椒游 离小孢子培养胚状体诱导率还比较低，最高为1.83个胚状体/花药(刘凡，赵泓，陈斌， 张月云.辣椒游离小孢子细胞团培养的胚状体形成.分子细胞生物学报，2007，40(6) 371-379)，在实际应用中受到一定限制。因此，如何提高游离小孢子胚状体诱导率，是关系 到辣(甜)椒游离小孢子培养技术能否广泛应用于遗传育种研究的关键技术之一。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种提高辣(甜)椒游离小孢子胚状体诱导率的方法，使得通过 小孢子培养快速获得纯合自交系的技术应用于辣(甜)椒遗传和新品种选育。本专利技术的基本原理是在一定条件下，离体培养植物小孢子的发育可以脱离在体 内时的正常的发育轨道，通过分裂增殖最终形成胚状体或愈伤组织。将形成的胚状体转接 于适宜的培养基上时，可获得完整的再生植株。本专利技术突出的创新点是通过提高培养用花蕾质量，采用从花蕾的取样、前期预处 理、花蕾消毒到花药剥取的全程低温控制，并于rc黑暗预培养一周后转到28°C黑暗培养 的关键技术，使得辣(甜)椒游离小孢子培养胚状体的诱导率最高达8. 4个胚状体/花药， 显著高于已公布的1个胚状体/花药的专利技术(专利号ZL 200610042616. 0)。提高胚状体诱导率的方法(本专利技术的创新)(1)提高花蕾质量培育壮苗、及时定植、合理肥水、及时摘取果实和已开放的花， 保持植株旺盛的生长势；使适宜取蕾的初花期和盛花期处于白天温度25 30°C，夜间温度 20°C左右的环境。(2)花蕾的选取晴天早晨8:00 10:00选取花瓣等于或略大于花萼且花药尖端 10% 25%呈淡紫色的花蕾，用封口袋盛装于冰盒中暂存。(3)花蕾的低温预处理将选取的适宜花蕾在4°C低温条件下预处理1天。(4)低温灭菌和花药的剥取灭菌用的酒精(70% )、次氯酸钠(2% )和无菌水皆 在4°C低温保存。灭菌的花蕾用无菌水洗涤后，浸泡于无菌水中并置于冰浴上备用，剥取花 药在冰浴上进行。(5)低温保存液体培养基液体培养基在加入固体培养基之前置于4°C冰箱低温 保存。(6)适温培养将接种的花药于7°C低温黑暗预培养一周后，转于28°C下继续黑暗培养直至形成子叶胚。本专利技术通过以下步骤完成(1)试材的确定选取具有综合优良性状的辣(甜)椒基因型作为试验材料。(2)培养基的制备基本培养基为Nitsch 组分(Nitsch and Nitsch 1969)。固体培养基-Nitsch组分+2%麦芽糖+1.0%活性炭+0.6%琼脂，pH为6. 0，于 121°C，1. IMpa条件下灭菌18分钟。液体培养基-Nitsch组分 +2 % 麦芽糖 +0. 5mg/LZT+l. Omg/LIAA, pH 为 5. 8，以 0. 45 μ m和0. 22 μ m微孔滤膜抽滤灭菌。(3)固体培养基的分装于超净工作台上将已灭菌的固体培养基在未凝固之前分 装至已灭菌的60 X 15mm培养皿中备用，每皿5mL。(4)花蕾的选取选取小孢子发育时期大多处于单核靠边期的花蕾。(5)花蕾的预处理将选取的适宜花蕾进行4°C低温预处理1天。(6)花蕾的灭菌于超净工作台上，用4°C预冷的70 %酒精表面灭菌30秒钟，之后 用4°C预冷的2%的次氯酸钠灭菌10 12分钟，然后用4°C预冷的无菌水冲洗3次，时间分 别为1、4、10分钟。(7)花药的剥取于超净工作台上，将无菌培养皿置于冰浴上，并用镊子从花蕾中 剥取花药，彻底去除花丝，操作中尽量避免损伤花药。(8)花药接种在装有固体培养基的培养皿中，加入4°C预冷的液体培养基每皿 3mL，之后接种花药12枚/皿，用Parafilm膜封口。(9)游离小孢子培养将接种花药的培养皿置于7°C条件下暗培养一周后转于 28°C下继续暗培养，经过12 18天花药自然开裂，释放出小孢子。(10)胚状体的形成暗培养期间陆续出现各种类型的胚状体，培养8周后将子叶 胚接种于分化培养基上，形成再生植株。本专利技术对辣(甜)椒小孢子培养采取的方法实用、步骤具体、适用的基因型广泛、 重复性好，可实现辣(甜)椒游离小孢子培养获得单倍体技术在创建DH群体上的广泛应 用。利用该方法获得的胚状体及再生植株，较已公布的专利技术有显著提高。9个性状优 良且品种间差异较大的基因型用该方法培养均获得了胚状体，最高达8. 4个胚状体/花药。 本专利技术创建的DH群体可广泛应用于辣椒的分子标记、基因图谱构建和自交系的选育等遗 传和育种工作中。附图说明图1单核靠边期的小孢子。图2培养3周后的细胞团。图3培养7周后的胚状体。图4培养获得的胚状体。图5胚状体的分化。图6胚状体的再生植株。以下结合附图专利技术人给出了具体实施例对本专利技术进一步详细阐述。具体实施例方式按照本专利技术的技术方案，具体实施步骤为(1)试材的确定选取综合性状优良的甜椒基因型08-488作为试验材料。(2)试材的培养及花蕾质量的提高培育壮苗、及时定植、合理肥水、及时摘取果 实和已开放的花，保持植株旺盛的生长势；使适宜取蕾的初花期和盛花期处于白天温度 25 30°C，夜间温度20°C左右的环境。(3)培养基的制备基本培养基为Nitsch and Nitsch(1969)组分(引自 J. P. Nitsch，C. Nitsch. Haploid Plants fromPollen Grains. Science, 1969,1 (3) :85_87·具体成分详见列表)。固体培养基-Nitsch组分+2%麦芽糖+1.0%活性炭+0.6%琼脂，ρΗ为6. 0，于 121°C，1. IMpa条件下灭菌18分钟。液体培养基-Nitsch组分 +2 % 麦芽糖 +0. 5mg/LZT+l. Omg/LIAA, ρΗ 为 5· 8，以 0. 45 μ m和0. 22 μ m微孔滤膜抽滤灭菌。分化培养基=Nitsch组分+2%蔗糖+0.9%琼脂，ρΗ为6.0，于121°C，1. IMpa条件 下灭菌18分钟。(4)培养基的分装于超净工作台上将已灭菌的固体培养基在未凝固之前分装于 已灭菌的60X 15mm培养皿，每皿5mL ；待固体培养基凝固后，接种花药前加入提前在4°C预 冷的液体培养基，每皿3mL。(5)花蕾的选择在08-488的初花期和盛花期，通过铁钒-苏木精压片法镜检本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提高辣（甜）椒游离小孢子培养胚状体诱导率的方法，包括以下步骤：（１）试材的确定：选取具有综合性状优良的辣（甜）椒基因型作为试验材料；（２）培养基的制备：基本培养基为ＮｉｔｓｃｈａｎｄＮｉｔｓｃｈ（１９６９）组分（引自Ｊ．Ｐ．Ｎｉｔｓｃｈ，Ｃ．Ｎｉｔｓｃｈ．ＨａｐｌｏｉｄＰｌａｎｔｓｆｒｏｍＰｏｌｌｅｎＧｒａｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６９，１（３）：８５－８７具体成分详见列表）固体培养基－Ｎｉｔｓｃｈ组分＋２％麦芽糖＋１．０％活性炭＋０．６％琼脂，ｐＨ为６．０，于高温１２８℃下继续暗培养，经过１２～１８天后花药自然开裂，将小孢子释放于液体培养基中。１℃高压１．１Ｍｐａ条件下灭菌１８分钟；液体培养基－Ｎｉｔｓｃｈ组分＋２％麦芽糖＋０．５ＺＴｍｇ／Ｌ＋１．０ｍｇ／ＬＩＡＡ，ｐＨ为５．８，以０．４５μｍ和０．２２μｍ微孔滤膜抽滤灭菌；分化培养基：Ｎｉｔｓｃｈ组分＋２％蔗糖＋０．９％琼脂，ｐＨ为６．０，于１２１℃，１．１Ｍｐａ条件下灭菌１８分钟；（３）培养基的分装：于超净工作台上将已灭菌的固体培养基在凝固之前分装于已灭菌的６０×１５ｍｍ培养皿中，每皿５ｍＬ；待固体培养基凝固后，在接种花药前加入每皿３ｍｌ液体培养基备用；（４）花蕾的选择：在初花期和盛花期，通过铁钒－苏木精压片法镜检确定小孢子发育时期与外部形态的对应关系，准确找到发育时期为单核靠边期的花蕾，此时花蕾的外部形态特征表现为花瓣等于或略大于花萼，并且花药尖端有１０～２５％呈淡紫色；（５）花蕾预处理：将选取的适宜花蕾置于４℃条件下处理１天；（６）花蕾消毒：在超净工作台上，用７０％的酒精表面消毒３０秒钟，之后用２％的次氯酸钠消毒１０分钟，然后用无菌水冲洗３次，时间分别为１、４、１０分钟；（７）花药的剥取：于超净工作台上，在无菌培养皿中用镊子从花蕾中剥取花药，彻底去除花丝，操作中尽量避免损伤花药；（８）花药接种：在装有固体培养基的培养皿中，加入液体培养基每皿３ｍＬ，之后接种花药１２枚／皿，用Ｐａｒａｆｉｌｍ膜封口；（９）游离小孢子培养：将接种的培养皿进行暗培养；（１０）胚状体的形成：培养期间各种类型的胚状体陆续出现，８周后将子叶胚接种于分化培养基上，形成再生植株；其特征是：（１）提高花蕾质量：培育壮苗、及时定植、合理肥水、及时摘取果实和已开放的花，保持植株旺盛的生长势；使适宜取蕾的初花期和盛花期处于白天温度２５～３０℃，夜间温度２０℃左右的环境；（２）采用从培养基...
【技术特征摘要】
一种提高辣(甜)椒游离小孢子培养胚状体诱导率的方法，包括以下步骤(1)试材的确定选取具有综合性状优良的辣(甜)椒基因型作为试验材料；(2)培养基的制备基本培养基为Nitsch and Nitsch(1969)组分(引自J.P.Nitsch，C.Nitsch.Haploid Plants from Pollen Grains.Science，1969，1(3)85-87具体成分详见列表)固体培养基-Nitsch组分+2％麦芽糖+1.0％活性炭+0.6％琼脂，pH为6.0，于高温121℃高压1.1Mpa条件下灭菌18分钟；液体培养基-Nitsch组分+2％麦芽糖+0.5ZTmg/L+1.0mg/LIAA，pH为5.8，以0.45μm和0.22μm微孔滤膜抽滤灭菌；分化培养基Nitsch组分+2％蔗糖+0.9％琼脂，pH为6.0，于121℃，1.1Mpa条件下灭菌18分钟；(3)培养基的分装于超净工作台上将已灭菌的固体培养基在凝固之前分装于已灭菌的60×15mm培养皿中，每皿5mL；待固体培养基凝固后，在接种花药前加入每皿3ml液体培养基备用；(4)花蕾的选择在初花期和盛花期，通过铁钒—苏木精压片法镜检确定小孢子发育时期与外部形态的对应关系，准确找到发育时期为单核靠边期的花蕾，此时花蕾的外部形态特征表现为花瓣等于或略大于花萼，并且花药尖端有10～25％呈淡紫色；(5)花蕾预处理将选取的适宜花蕾置于4℃条件下处理1天...
【专利技术属性】
技术研发人员：申书兴，银婷，宋彦平，顾爱侠，陈雪平，王彦华，轩淑欣，李晓峰，罗双霞，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]
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