半滑舌鳎卵裂雌核发育鱼苗的诱导方法技术

一种半滑舌鳎卵裂雌核发育鱼苗的诱导方法，包括：半滑舌鳎精子冷冻保存、精子的紫外照射、卵裂雌核发育鱼苗的诱导及鉴定方法。本发明专利技术建立了半滑舌鳎精子冷冻保存方法，建立了采用静水压抑制第一次卵裂诱导半滑舌鳎雌核发育胚胎染色体加倍的方法，筛选到半滑舌鳎精子冷冻保存的有效稀释液和冷冻方法，筛选到适合半滑舌鳎卵裂雌核发育的静水压休克起始时间、静水压力和处理时间，建立了半滑舌鳎卵裂雌核发育鱼苗的鉴定方法。本方法首次获得了半滑舌鳎卵裂雌核发育鱼苗，雌核发育鱼苗诱导率可达０．２５％；本发明专利技术具有先进、高效、实用、可靠的特点，可用于解决半滑舌鳎雄性生长慢、雌性比例低、养殖成本高的问题，在半滑舌鳎苗种繁育、性别控制、全雌苗种培育以及纯系建立等方面具有重大应用价值和广阔的推广应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本技术属于鱼类生物
，获得卵裂雌核发育二倍体鱼苗的方法。是一种抑制半滑舌鳎雌核发育卵第一次卵裂
技术介绍
半滑舌鳎(Cynoglossus semiliaevis)是我国特有的一种名贵经济海水鱼类，属于 近海温水性底层鱼类，我国沿海均有分布，以黄海、渤海为多。半滑舌鳎是目前海水 鱼类养殖的主要品种之一，由于其味道鲜美、肉质细嫩、营养丰富，深受广大消费者欢 迎，其市场价值极高，养殖前景非常广阔。 鉴于半滑舌鳎的养殖潜力和潜在的经济社会效益，近年来，我国科技工作者对 半滑舌鳎生殖调控和自然产卵技术进行了大量研究工作，主要采用人工控制光照和水温 的方法剌激半滑舌鳎亲鱼成熟和自然产卵，该项技术于2002年获得成功。在人工养殖 条件下，通过控制亲鱼养殖池的水温和光照时间，诱导半滑舌鳎亲鱼成熟并自然产卵， 获得了半滑舌鳎受精卵，并生产出了半滑舌鳎苗种(中国水产科学研究院黄海水产研究 所，姜言伟等，海洋水产研究，1993;柳学周等，海洋水产研究，2006)。不过半滑舌鳎 雌、雄个体生长差异巨大，其雌性个体比雄性个体大2-4倍(中国水产科学研究院黄海水 产研究所，孟田湘等，海洋水产研究，1988)，半滑舌鳎鱼苗经过l年养殖后，雌性个体 可长到500-750克，而雄性个体则只有50-150克。由于雄性个体生长过慢，影响了商品 鱼的质量，降低了半滑舌鳎的养殖产量，增加了养殖成本，因而严重影响了半滑舌鳎苗 种的推广及养殖产业的发展。 因此，对半滑舌鳎开展雌核发育技术的研究、研制全雌育种技术，培育和推广 半滑舌鳎全雌苗种，对于提高半滑舌鳎的养殖产量和产品质量非常重要。如果研制出半 滑舌鳎全雌苗种，进行大面积推广后，将提高半滑舌鳎养殖产量80-100%，每年将增加 10多亿元的经济社会效益。 雌核发育是生产鱼类全雌苗种的重要途径。这条技术途径在其它淡水鱼类和少 数海水鱼类上有过一些研究，并生产出了一些单性苗种。我国最早在鲤鱼上建立了人工 减数雌核发育技术(中国科学院水生生物研究所，吴清江，遗传学报1981);随后，在鲢 鱼也建立了减数雌核发育诱导方法(中国水产科学研究院长江水产研究所，潘光碧等， 淡水渔业1995);同时， 一些学者也开展了海水鱼类牙鲆减数雌核发育技术的研究(中国 科学院海洋研究所刘静等，海洋与湖沼1999)。不过，上述鱼类的性别决定机制均为XY 型，即雄性为XY型、雌性为XX型性别决定，雌鱼只产生一种卵子，即X卵子，而雄鱼 则产生XY型2种精子。最近，国内一些学者开展了半滑舌鳎性别相关分子标记筛选的 研究，以及半滑舌鳎性腺发育和性别转换技术的研究等项工作，成功地筛选到半滑舌鳎 雌性特异AFLP分子标记，建立了半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR技术(黄海水产研究所 陈松林等，Mar Biotechnol， 2007)，发现半滑舌鳎雌性个体存在异型性W染色体(黄海 水产研究所周丽青等，水产学报，2005)。 AFLP分子标记和染色体分析研究表明，半滑舌鳎为ZW型性别决定机制，即雌鱼产生Z型和W型两种卵子，而雄鱼只产生一种Z型精子。这种zw型雌鱼产生的卵子，经雌核发育后将产生zz型雄鱼和ww型超雌鱼两 种类型。ww型超雌鱼与zz型雄鱼交配后将产生全雌苗种。鱼类雌核发育包括减数雌核发育和卵裂雌核发育2种类型。减数雌核发育是采用紫外线照射过的鱼类精子剌激卵 子的发育，形成单倍体胚胎，然后在第二次减数分裂时期采用温度休克或压力休克抑制 第二极体的排出，从而使雌核发育胚胎进行染色体加倍，形成雌核发育二倍体；由于染 色体之间的交换重组，这样形成的雌核发育二倍体为杂合二倍体，很难获得纯合的雌核 发育二倍体；而卵裂雌核发育(又称有丝分裂雌核发育)则是通过抑制雌核发育单倍体胚 胎的第一次卵裂而达到染色体加倍的目的，这样获得的雌核发育二倍体为同质雌核发育 二倍体，纯合度很高，理论上可以得到每个基因位点都纯合的雌核发育二倍体，因此卵 裂雌核发育在遗传连锁图谱构建、快速建立纯系和隐性有害基因的剔除等方面具有重要 应用价值，是制备鱼类克隆系和获得WW超雌半滑舌鳎鱼的有效途径。因此鱼类卵裂雌 核发育研究受到了国际上的高度重视，由于卵裂雌核发育的诱导难度大、二倍体成活率 低，尽管已经开展了近20年的研究，但有关鱼类卵裂雌核发育的研究目前只在真鲷(日 本Kato et al.， 2002Aquacul ture)、牙鉀(日本Yamamoto， 1999Aquacul ture)和舌齿鱼卢(意 大利Francescon etal.， 2004Aquaculture)等几种鱼类上有过报道，而这几种鱼类都是XY 性别决定类型的鱼类。而有关ZW性别决定类型的半滑舌鳎卵裂雌核发育的研究，迄今 国内外均未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立人工诱导半滑舌鳎卵子进行卵裂(有丝分裂)雌核发育的 技术方法，获得卵裂雌核发育二倍体鱼苗。 本专利技术
技术实现思路
包括二个方面 一、鱼类精子的遗传失活和剌激卵子雌核发育 方法；二、卵裂雌核发育二倍体鱼苗的诱导和鉴定方法 —、鱼类精子的遗传失活和剌激卵子雌核发育方法它的
技术实现思路
包括l.雄 鱼培育和精子的采集；2.精子的冷冻保存与解冻；3.精子的紫外线照射；4.未受精卵的采集及与紫外线照射精子的受精。1.雄鱼培育和精子的采集 选择体表无损伤的半滑舌鳎雄性成鱼作为亲鱼，体重为150-500g/尾，按每平 方米一雌二雄的密度进行室内流水养殖，投喂贝类、野杂虾和活沙蚕等新鲜活饵料，每 天的投饵量为鱼体重的2_4%。对达到性成熟年龄(雄性2年)的亲鱼，共选择了400尾亲 鱼，在繁殖前2-3个月进行控温控光；在此期间，水温按每10天升高0.5-rC从17-19°C 逐步升高到21-23°C，并维持在此温度；光照时间按每IO天延长1小时由每天8小时逐 渐延长到16小时，并维持在16小时。 自人工控光、控温的亲鱼培育池中选取达到性成熟的半滑舌鳎雄鱼，采用腹部 挤压法采集精液，先将雄鱼泄殖孔周围腹部的水分用毛巾擦干，用玻璃吸管吸取乳白色 的精液。将采集的精液盛入25ml的干燥玻璃瓶中，将装有精液的玻璃瓶置于冰上。精 液在运送途中避免光线直射。精子活力在70%以上者用于冷冻保存。 2.精子的冷冻保存与解冻采用精子冷冻保存液MPRS(NaCl 60.05-60.65mM， NaH2P041.7_1.9mM ; NaHC032.5—3.5mM， KC1 5.1—5.3mM， CaCl 2.2H20 1.0—1.2mM， MgCl2.6H2O1.0—1.2mM， D-Glucose 55-56mM)进行精子的冷冻保存。向上述冷冻保存液中添加20 %的抗冻 剂DMSO(二甲亚砜)，置于4t:冷却，将半滑舌鳎新鲜精液与上述冷却的冷冻保存 液-DMSO混合液按l : l比例混合，然后分装到2.0ml的冷冻保存管中，在4。C平衡5min 后，采用三步冷冻法将精子放入液氮中冷冻保存。冷冻精子解冻时，先将盛冻精的冻存 管从液氮中(-196° )提到液氮蒸汽中(约-160-180度)平衡5分钟，然后将冻存管放在 38-40°水浴中进行快速解冻。 3.精子的紫外线照射 剌激半滑舌鳎卵子进行卵裂雌核发育的精子可用新鲜的或冷冻保存的同源精子 或异源本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种半滑舌鳎卵裂雌核发育鱼苗的诱导方法，其特征在于它的技术方法包括二个方面：　　　　（１）、鱼类精子的遗传失活和刺激卵子雌核发育方法；　　　　（２）、卵裂雌核发育鱼苗的诱导和鉴定方法；　　　　（１）、鱼类精子的遗传失活和刺激卵子雌核发育方法：它的技术内容包括：　　　　Ａ．雄鱼培育和精子的采集；　　　　Ｂ．精子的冷冻保存与解冻；　　　　Ｄ．精子的紫外线照射；Ｄ．未受精卵的采集及与紫外线照射精子的受精；　　　　Ａ．雄鱼精子的采集：　　　　自人工控光、控温的亲鱼培育池中选取达到性成Ｂ、卵裂雌核发育鱼苗的微卫星鉴定方法；　　　　Ａ、静水压诱导卵裂雌核发育鱼苗的方法；它的技术内容包括：ａ、雌核发育胚胎染色体加倍起始时间的确定；ｂ、静水压压力和处理持续时间的确定；　　　　ａ．雌核发育胚胎染色体加倍起始时间的确定：：染色体加倍采用静水压方法进行；在“授精”后１５．５－４２．５ｍｉｎ，将卵倒入静水压机的压力缸中，采用６０－７０Ｍｐａ的压力进行压力休克处理，处理时间为４－６分钟；休克处理完毕后将卵移入２１－２３℃海水中培养，统计雌核发育二倍体率；结果发现雌核发育卵在“授精”后２１－２５ｍｉｎ进行静水压休克处理都能够诱导产生雌核发育二倍体，且以“授精”后２１．５－２４．５ｍｉｎ的诱导率最高；因此，卵裂雌核发育诱导的静水压休克处理的有效起始时间确定为授精”后２１．５－２４．５ｍｉｎ；　　　　ｂ．静水压压力和处理持续时间的确定：　　　　在确定了静水压休克起始时间后，需要确定静水压压力和和休克持续时间；将与紫外失活精子“授精”的卵，在授精后４－６分钟，分别采用５０、６０、７０和８０Ｍｐａ压力进行处理，在每个压力下分别处理２ｍｉｎ，４ｍｉｎ和６ｍｉｎ；统计雌核发育鱼苗的孵化率；结果表明在休克压力６０－７０Ｍｐａ，处理４－６ｍｉｎ条件下都可以诱导雌核发育二倍体，其中在６５－－７０Ｍｐａ处理４－６ｍｉｎ的雌核发育诱导率最高；因此确定半滑舌鳎卵裂雌核发育诱导的静水压有效压力为６５－７０Ｍｐａ，有效处理持续时间为４－６分钟；　　　　Ｂ、卵裂雌核发育鱼苗的微卫星鉴定方法：　　　　采取高盐法和Ｏｍｅｇａ公司的Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．［ＴＭ］↑ＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅ　　Ｇｅｎｏｍｉｃ　　ＤＮＡ试剂盒提取半滑舌鳎雌核发育鱼和正常鱼苗基因组ＤＮＡ，采用我们筛选到的半滑舌鳎多态性微卫星标记进行雌核发育鱼苗鉴定；共使用１０对微卫星引物：　　　　Ｃｙｓｅ１４７（５－ＡＣＣ...

【技术特征摘要】
一种半滑舌鳎卵裂雌核发育鱼苗的诱导方法，其特征在于它的技术方法包括二个方面(1)、鱼类精子的遗传失活和刺激卵子雌核发育方法；(2)、卵裂雌核发育鱼苗的诱导和鉴定方法；(1)、鱼类精子的遗传失活和刺激卵子雌核发育方法它的技术内容包括A.雄鱼培育和精子的采集；B.精子的冷冻保存与解冻；D.精子的紫外线照射；D.未受精卵的采集及与紫外线照射精子的受精；A.雄鱼精子的采集自人工控光、控温的亲鱼培育池中选取达到性成熟的半滑舌鳎雄鱼，采用腹部挤压法采集精液，先将雄鱼泄殖孔周围腹部的水分用毛巾擦干，用玻璃吸管吸取乳白色的精液；将采集的精液盛入25ml的干燥玻璃瓶中，将装有精液的玻璃瓶置于冰上；精液在运送途中避免光线直射。精子活力在70％以上者用于冷冻保存；B.精子的冷冻保存与解冻采用精子冷冻保存液MPRS进行半滑舌鳎精子的冷冻保存，向MPRS冷冻保存液中添加20％的抗冻剂二甲亚砜DMSO，置于4℃冷却，将半滑舌鳎新鲜精液与上述冷却的冷冻保存液-DMSO混合液按1∶1比例混合，然后分装到2.0ml的冷冻保存管中，在4℃平衡5min后，采用三步冷冻法将精子放入液氮中冷冻保存。冷冻精子解冻时，先将盛冻精的冻存管从-196°液氮中提到-160--180度的液氮蒸汽中平衡5分钟，然后将冻存管放在38-40°水浴中进行快速解冻；C.精子的紫外线照射刺激半滑舌鳎卵子进行卵裂雌核发育的精子可用新鲜的或冷冻保存的同源精子或异源精子；当精子活力达到60％以上者均可用于紫外线灭活处理。精子的紫外照射条件为将50μL新鲜的或100μL冷冻解冻的精液用1-1.2mL精子稀释液MPRS稀释，平铺于培养皿中，将培养皿置于紫外交联仪(UVC500)中，用40-70mJ/cm2紫外线照射，照射后精子的活力保持在20-35％。然后与半滑舌鳎卵“授精”，刺激卵子进行雌核发育；精子稀释液MPRS的配方为KCl 0.39g/L，CaCl2 2H2O 0.17g/L，NaHCO30.25g/L，NaCl 3.59g/L，NaH2PO4 0.22g/L，MgCl2 0.23g/L，Glucose 1.0g/L；D.半滑舌鳎未受精卵的采集及与紫外线照射精子的授精选择性成熟的半滑舌鳎雌鱼，在产卵前1h采用人工挤压腹部法采卵，将卵采入250-500ml干燥的烧杯中，置于20-23℃室温下；将以上经过紫外线照射的精液加入半滑舌鳎卵中，轻轻摇动混匀，然后加入温度为20-23℃的2倍于卵量的海水完成“受精”过程；授精后将卵置于20-23度海水中进行孵化；(2)、卵裂雌核发育鱼苗的诱导和鉴定方法包括A、静水压诱导卵裂雌核发育鱼苗的方法；B、卵裂雌核发育鱼苗的微卫星鉴定方法；A、静水压诱导卵裂雌核发育鱼苗的方法；它的技术内容包括a、雌核发育胚胎染色体加倍起始时间的确定；b、静水压压力和处理持续时间的确定；a.雌核发育胚胎染色体加倍起始时间的确定染色体加倍采用静水压方法进行；在“授精”后15.5-42.5min，将卵倒入静水压机的压力缸中，采用60-70Mpa的压力进行压力休克处理，处理时间为4-6分钟；休克处理完毕后将卵移入21-23℃海水中培养，统计雌核发育二倍体率；结果发现雌核发育卵在“授精”后21-25min进行静水压休克处理都能够诱导产生雌核发育二倍...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈松林，季相山，田永胜，杨景峰，徐亘博，邵长伟，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：95[]