一种高含量多种酚酸类化合物的丹参毛状根及其培养技术制造技术

本发明专利技术提供了一种高含量酚酸类化合物的丹参毛状根ＳｍＨｒ１及其培养方法，本发明专利技术的丹参毛状根含有丹酚酸Ｂ、丹酚酸Ｋ、丹酚酸和迷迭香酸化合物，含量高于野丹参。应用本发明专利技术的培养方法可以显著提高丹参毛状根的生长量积累及药用成分丹酚酸类化合物的含量，从而为大规模生产这些化合物提供了高产的株系，降低生产成本，促进工业化生产。

Salvia miltiorrhiza hairy root with high content of phenolic acids and culture technique thereof

The invention provides a high content of phenolic compounds in Salvia miltiorrhiza hairy root SmHr1 and cultivation method of the invention of hairy root containing salvianolic acid B and salvianolic acid K and salvianolic acid and rosmarinic acid compounds were higher than that of wild Salvia miltiorrhiza. Cultured by the method of the invention can significantly improve the content of Salvia miltiorrhiza hairy root growth and accumulation of medicinal ingredients of salvianolic acids, which provides high yield strains for the large-scale production of these compounds, to reduce production costs, promote industrial production.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及中药。具体涉及一种高含量多种酚酸类化合物的丹参毛状根SAwHrl及其培养 技术。
技术介绍
丹参(Sa/v^/m'Wwr&加Bunge)是常用中药，其药用部位为根。丹参及以丹参为 主的中药制剂是临床治疗心血管系统疾病的首选药之一。除用于饮片外，丹参还是复方 丹参滴丸、复方丹参片、丹参注射液等很多种中成药的主要原料。丹参的主要活性成分有丹参酮等二萜醌类化合物和丹酚酸等水溶性酚酸类化合物。 丹酚酸类化合物的药用价值越来越受到重视，目前已分离的丹酚酸类化合物有二十几 种，均具有很强的抗过氧化和清除自由基的功能。丹酚酸B镁盐作为抑制肝纤维化和 肝硬化的二类新药己获得中国国家专利；以丹酚酸B为主要成分的注射用丹参多酚酸 盐作为治疗冠心病和心绞痛的药物效果显著；此外，丹酚酸在治疗脑血管病基础与临床 研究中表现出独特的作用效果启示丹酚酸有望成为抗脑缺血理想药物。由此可见，丹 酚酸作为治疗肝病、心血管疾病和抗脑缺血的有效药物进入临床使用，对丹酚酸原料的 需求将会迅猛增加。若单纯依赖丹参的大面积栽培来提取丹酚酸类化合物，不仅占用了耕地，也增大了 提取成本。因此，怎样应用中药生物技术，利用丹参毛状根提高和生产丹酚酸类药用资 源，是缓解药材资源压力的有效途径。另一方面，这样对降低丹酚酸制剂的生产成本、 提高制剂质量也具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是研究设计能获得稳定产生多种酚酸类化合物的丹参毛 状根株系，提供高含量丹酚酸制剂的生产原料。本专利技术提供了一种高含量多种酚酸类化合物的丹参毛状根SmHrl。该毛状根(Hairy root)是本专利技术人首次由发根农杆菌侵染丹参叶片诱导获得，因其来源于丹参(S/v/a w/Wo/T/ /za Bunge),故命名为SmHrl。丹参毛状根SwHrl在固体培养基和液体培养基 中均呈褐色毛发状，固体培养时形态略粗壮。其生长失去向地性，且能在不添加任何激5素的MSOH固体培养基及MSOH液体培养基(配方见实施例1)中持续稳定生长繁殖。 并能稳定合成多种丹酚酸类化合物。本专利技术的另一 目的是提供了上述丹参毛状根SmHrl的培养方法。该方法包括下列步骤(1) 应用YMB液体培养基培养的发根农杆菌(v4gro6aeWww r/^ogem/s)侵染野 生型丹参(Sa/v/a m/Wo厅/H'za Bunge)叶片，在MSOH固体培养基中进行培 养，以筛选获得丹参毛状根S附Hrl;(2) 将毛状根SwHrl在MSOH固体培养基(配方见实施例l)， 25°C，黑暗静置 培养3 5周后，选取长势较为粗壮鲜嫩的毛状根转接到MSOH液体培养基(配 方见实施例l)中25'C，黑暗，120rpm水平回旋振荡培养2 4周；再选取 长势良好的毛状根转接到MSOH固体培养基中培养；如此反复，进行3 5次 交替继代培养，筛选到在MSOH液体培养基中生长快速、遗传稳定、并能稳 定产生多种酚酸类成分的丹参毛状根株系SmHrl;(3) 应用持续液体继代培养(即液体培养基中培养的毛状根转接到液体培养基持 续培养的方法)、接种14天后在培养基中添加茉莉酸甲酯，使其终浓度为5 30nM，提高丹参毛状根的生长量积累及药用成分丹酚酸类化合物的含量。YMB液体培养基组成(g/L)Manitol 10Yeast Extract 0.4NaCl 0.1MgS04 7H20 0.2K2HP04 0.5 用NaOH和HC1调pH至7.2后于12rC高庄灭菌。MSOH固体培养基组成(mg/L)(1) 大量元素KN03 1，900CaCl2 2H20 440MgS04 7H20 370KH2P04 170(2) 微量元素KI 0.83 H3B03 6.2MnS04 4H20 22.3ZnS04 7H20 8.6Na2Mo04 2H20 0.25CuS04 5H20 0.025CoCl2 6H20 0.025(3) Fe盐Na2EDTA 2H20 37.3FeS04 7H20 27.8(4) 有机元素肌醇 100烟酸 0.5盐酸吡眵醇 0.5盐酸硫酸胺素 0.4甘氨酸 2.0 用NaOH和HCl调pH5.8后，添加2%琼脂粉，于12rC高压灭菌。MSOH液体培养基组成(mg/L)(1) 大量元素KN03 1，900CaCl2 2H20 440MgS04 7H20 370KH2P04 170(2) 微量元素KI 0.83H3B03 6.2MnS04 4H20 22.3ZnS04 7H20 8.6Na2Mo04 2H20 0.25CuS04 5H20 0.025CoCl2 6H20 0.025(3) Fe盐Na2EDTA 2H20 37.3FeS04 7H20 27.8(4) 有机元素肌醇 100烟酸 0.5盐酸吡哆醇 0.5 盐酸硫酸胺素 0.4 甘氨酸 2.0 用NaOH和HC1调pH5.8后于121C高压灭菌。本专利技术丹参毛状根SwHrl在本专利技术的培养方法下，接种培养21天生长量积累达到 1.05士0.06g (干重)；丹酚酸B含量为4.57士0.85W (干重)，与中国四川中江地区一年 生野丹参生药材含量相当，后者含量为6.25±0.08% (干重)；迷迭香酸含量为4.67±0.09 % (干重)，远高于中国四川中江地区一年生野丹参生药材中迷迭香酸含量，后者为 0.49±0.08% (干重)；多次LC-MS初步确定为丹酚酸K和丹酚酸L的两种化合物，以 吸收峰与之相近的丹酚酸B为内参，HPLC测得其含量分别为7.98±0.63%和 0.92±0.09%，均远远高于野丹参(见表一)。应用本专利技术的丹参毛状根SmHrl及本专利技术的培养方法可以显著提高丹参毛状根的 生长量积累及药用成分丹酚酸类化合物的含量，从而为大规模生产这些化合物提供了高 产的株系及培养方法，将有利于提高以丹酚酸类化合物为主要成分的药用制剂纯度，降 低其生产成本，促进工业化生产。表l丹参毛状根S/nHrl与野丹参中酚酸类成分含量比较丹酚酸B(mg/mg迷迭香酸(mg/mg丹酚酸K (mg/mg干丹酚酸L (mg/mg千生长时期干重％)干重％)重％) **《 胸丹参毛状根SwHrl4.57±0.85%*4.67±0.09%*7.98±0.63%*0.92±0.09%*21天四川中江野丹参6.25±0.08%*0.49±0.08%*未检测到未检测到一年*数据均为三批次样品测定结果。**丹酚酸K、 L含量以丹酚酸B为内参进行计算。表2丹参毛状根SmHrl不同培养基中培养21天生长量及酚酸类成分含量比较生长量(g干重)丹酚酸B(mg/mg迷迭香酸(mg/mg丹酚酸K (mg/mg干丹盼酸L (mg/mg啊重％) **干重％) **MSOH+茉莉酸甲酯1.05±0.06*4.57±0.85%*4.67±0.09%*7,98±0.63%*0.92±0.09%*MSOH'0.94±0.12*3.95±0.03%*4.51±0.03%*4.83±0.06%*1.06±0.05%**数据均为三批次样品测定结果。**丹酚酸K、 L含量以丹酚酸B为内参进行计算。丹参毛状根中酚酸类成分LC-MS鉴本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高含量多种酚酸类化合物的丹参毛状根，其特征在于该丹参毛状根的丹酚酸Ｂ含量为４．５７±０．８５％干重；迷迭香酸含量为４．６７±０．０９％干重；丹酚酸Ｋ含量为７．９８±０．６３％干重和丹酚酸Ｌ含量为０．９２±０．０９％干重。

【技术特征摘要】
1、一种高含量多种酚酸类化合物的丹参毛状根，其特征在于该丹参毛状根的丹酚酸B含量为4.57±0.85％干重；迷迭香酸含量为4.67±0.09％干重；丹酚酸K含量为7.98±0.63％干重和丹酚酸L含量为0.92±0.09％干重。2、根据权利要求1所述的一种高含量多种酚酸类化合物的丹参毛状 根，其特征在于其中所述丹酚酸K结构为3.<image>image see original document page 2</image>4. 一种如权利要求1所述的高含量多种酚酸类化合物的丹参毛状根 的培养方法，其特征在于该方法包括下列步骤-(1) 应用YMB液体培养基培养的发根农杆菌侵染野生型丹参叶片， 在MSOH固体培养基中进行培养，筛选获得丹参毛状根(2) 将丹参毛状根在MSOH固体培养基中，25°C，黑暗静置培养3 5 周后，选取长势较为粗壮鲜嫩的毛状根转接到MSOH液体培养基中，25°C，黑暗，120rpm水平回旋振荡培养2 4周；再选取长势良好的毛状根转接 到MSOH固体培养基中培养；如此反复，进行3 5次交替继代培养，筛选 到在MSOH液体培养基中生长快速、遗传稳定、并能稳定产生多种酚酸类 成分的丹参毛状根株系；(3)应用持续液体继代培养，将液体培养基中培养的毛状根转接到 液体培养基持续培养、接种14天后在培养基中添加茉莉酸甲酯，使其终 浓度为5 30MM;所述YMB液体培养基组成为g/L Manitol 10 Yeast Extract 0.4 NaCl 0.1 MgS04 7H2...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵淑娟，王峥涛，胡之璧，周吉燕，张金家，
申请(专利权)人：上海中医药大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]