生成物为Ｈ＊Ｏ＊的氧化酶类活性检测方法技术

本发明专利技术提供了一种生成物为Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］的氧化酶类活性检测方法，利用氧化酶氧化底物生成Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］，以检测Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］含量从而达到对氧化酶活性的定量检测，反应显色剂选用Ｎ，Ｎ－二甲苯胺，４－氨基胺替吡啉，显色剂与Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］反应生成紫萝蓝色产物，产物在波长５５０ｎｍ处测定光密度值，以０．００１ΔＯＤ↓［５５０］.ｍｉｎ↑［－１］底为一个酶活单位（Ｕ），通过检测产物浓度来间接地测出氧化酶的活性速率，于传统方法相比，本方法对Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］浓度的最低检测量可从１．２５μｍｏｌ.Ｌ↑［－１］提高到０．６５μｍｏｌ.Ｌ↑［－１］，从而提高了氧化酶活性的检测率，并且其显色产物具有良好的稳定性和重现性，可以延长反应时间来提高检测效果。

Oxidase activity assay for the production of H * O *

The present invention provides a method for generating H oxidase activity detection: 2 O: 2, the use of enzyme substrate oxidation to generate H: 2 O: 2, H: to detect 2 O down 2 content so as to achieve quantitative detection of enzyme activity. The reaction of chromogenic agent selected by N, N - Xylidyl, 4 - amino amine for pyrine, chromogenic agent and H: 2 O: 2 ziluo blue reaction product, product determination of optical density at the wavelength of 550nm, with 0.001 OD: 550,.Min = - at the end of 1 as a unit of enzyme activity (U), indirectly measured by detecting the activity rate oxidase product concentration in, rather than the traditional method, the method of H case, the minimum detection amount of 2 O down 2 concentration from 1.25 Mu Mol.L = - 1, up to 0.65, mol.L = 1, in order to improve the detection rate and the enzyme activity, the chromogenic products have good stability and repeatability, can improve the detection effect of prolonging the reaction time.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物酶活性检测领域，具体涉及以生成物为HA的氧化酶类活性 的检测，包括植物体内HA含量的检测。
技术介绍
氧化酶类是生物体氧化代谢过程中的重要物质，决定了生物体内的氧化代 谢进程和次生代谢物质的产生与消除。使植物在不同的生长环境下具有不同的 适应状态。如多胺(Polyamines， PAs )是生物体氮代谢过程中产生的一类次生 代谢物质，植物体在受到生物的和非生物的胁迫时，体内的多胺浓度急剧地变 化。多胺氧化酶(Polyamine oxidase, PA0)是催化生物体内PAs氧化的关鍵 酶，通过调节细胞的PAs水平和生成物的浓度，参与各种植物体对逆境胁迫的 反应和生长发育过程。因而PA0是PAs代谢研究的一个重要环节；而多酚氧化 酶是氧化酚类的关键酶，是研究酚类氧化代谢的关键酶。诸如此类氧化酶在植 物体内还有很多。这类氧化酶的共同特点是氧化底物时有产物HA的生成。从而 可以检测&02含量以达到对氧化酶活性的定量检测。传统检测方法是1972年 Smith提出并应用的PAO活性的检测方法。但由于其灵敏性较低和检测产物稳定 性较差等，在很多植物中都检测不到PAO的活性。影响了传统检测方法应用的 广泛性。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种生成物为H202的氧化酶类活性检测 方法，该检 测方法能提高氧化酶活性的检测率，H202浓度最低检测量可从1.25jamo1 L—'提 高至ij 0. 65 (amol . L—。其具体搡作技术如下(1 )制作氧化酶提取液称取0. 5 g试材加入1. 6 mL磷酸缓冲液(0. lmol -1/1，pH 6.5 )于冰浴中研磨后以10000 xg离心20 min (4°C ),上清液即为氧化酶 提取液；(2) 制作显色液100 mL显色液(用0. lmol， pH 6. 5的磷酸缓冲液配)的 成分中含25juL N,N-二甲基苯胺，10 mg 4-氨基氨替吡啉；(3) 制作反应混合液该反应混合液含2. 5 mL磷酸缓冲液(0. lmol . L—1， PH6. 5)， 0. 2mL显色液，0. 2 mL氧化酶提取液，0. 1 mL过氧化物酶溶液(250 U m1/1);(4) 将反应混合液加入20 mmol L—'底物0.1 mL起动反应后，混合反应液 置于25匸中反应30min。所述底物依氧化酶的种类而定，如检测多胺氧化酶， 其底物为多胺；检测多酚氧化酶，其底物为各种酚类；(5 )用分光光度计测定波长550nm处光密度值，以0. 001 AOD55。 . min-'为 一个酶活单位(U)。(6)用加入5%高氯酸的提取液为对照。本专利技术的方法，&02浓度的最低检测量可从1.25pmo1 .L-'提高到0. 65ji mol*L—、提高了氧化酶活性的检测率。并且其显色产物具有良好的稳定性与重 现性，可以延长反应时间来提高检测效果。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生成物为Ｈ２Ｏ↓［２］的氧化酶类活性检测方法，具体操作技术如下：　　（１）制作氧化酶提取液：称取０．５ｇ试材加入１．６ｍＬ磷酸缓冲液（０．１ｍｏｌ.Ｌ↑［－１］，ｐＨ　６．５）于冰浴中研磨后以１００００×ｇ离心２０ｍｉｎ（４℃），上清液即为氧化酶提取液；　　（２）制作显色液：１００ｍＬ显色液（用０．１ｍｏｌ，ｐＨ　６．５的磷酸缓冲液配）的成分中含２５μＬ　Ｎ，Ｎ－二甲基苯胺，１０ｍｇ　４－氨基氨替吡啉；　　（３）制作反应混合液：该反应混合液含２．５ｍＬ磷酸缓冲液（０．１ｍｏｌ.Ｌ↑［－１］，ｐＨ　６．５），０．２ｍＬ显色液，０．２ｍＬ氧化酶提取液，０．１ｍＬ过氧化物酶溶液（２５０Ｕ.ｍＬ↑［－１］）；　　（４）将反应混合液加入２０ｍｍｏｌ.Ｌ↑［－１］底物０．１ｍＬ起动反应后，混合反应液置于２５℃中反应３０ｍｉｎ，所述底物依氧化酶的种类而定，如检测多胺氧化酶，其底物为多胺；检测多酚氧化酶，其底物为各种酚类；　　（５）用分光光度计测定波长５５０ｎｍ处光密度值，以０．００１ΔＯＤ↓［５５０］.ｍｉｎ↑［－１］为一个酶活单位（Ｕ）；　　（６）用加入５％高氯酸的提取液为对照。

【技术特征摘要】
1、一种生成物为H2O2的氧化酶类活性检测方法，具体操作技术如下(1)制作氧化酶提取液称取0.5g试材加入1.6mL磷酸缓冲液(0.1mol·L-1，pH 6.5)于冰浴中研磨后以10000×g离心20min(4℃)，上清液即为氧化酶提取液；(2)制作显色液100mL显色液(用0.1mol，pH 6.5的磷酸缓冲液配)的成分中含25μL N，N-二甲基苯胺，10mg 4-氨基氨替吡啉；(3)制作反应混合液该反应混合液含2.5mL磷酸缓冲液(0.1mol·...

【专利技术属性】
技术研发人员：周静，汪天，
申请(专利权)人：周静，
类型：发明
国别省市：36[中国|江西]