一种ＧＳＮＯ还原酶活力定量检测试剂盒，包括盒体（７）、盒盖（８）和固定板（６），盒体内放置着试剂瓶（１，４、５）和ＥＰ管（２、３），三个试剂瓶和两个ＥＰ管由固定板（６）分隔固定，每个试剂瓶上有说明标签，试剂瓶内密封包装着固定重量配比和准确称量的试剂，试剂瓶（１）中装有ｐＨ８．０的２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液，ＥＰ管（２）中装有ＮＡＤＨ溶液，ＥＰ管（３）中装有ＧＳＨ和ＮａＮＯ↓［２］固体，试剂瓶（４）中装有ＨＣｌ－ＥＤＴＡ溶液，试剂瓶（５）中装有磺基水杨酸ＥＤＴＡ溶液，ＥＰ管（３）外有黑色塑料袋包装，试剂瓶（１，４，５）均为白塑料瓶，盒体（７）和盒盖（８）用硬纸或薄塑料板制成，固定板（６）用塑料泡沫板制成。使用本试剂盒不需要昂贵的设备，样品处理简单。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种GSN0还原酶活力检测用的试剂盒，适用于与GSN0还原酶 和一氧化氮信号通路相关疾病的病因及发病机理的基础研究，适用于各种环境 或化学因素引起的GSNO还原酶活力水平变化的定量检测。技术背景亚硝基硫醇(S-nitrosothiol,SNO)是一氧化氮与硫醇类化合物形成的酯， 在一氧化氮信号通路中起重要作用。GSNO还原酶是一种SNO的代谢酶，可 调控机体SNO浓度水平，并在SNO相关疾病中起重要作用。因此，研究GSNO 酶活力的诱导在SNO相关信号通路中有重要意义，并有可能成为SNO相关疾 病中的关键事件。目前国内外主要根据NADH的氧化反应来测定GSNO还原酶活力，该方 法灵敏度高，简单方便。但由于需要称取和配制的试剂较多而使用非常不方便， 且会因为实验人员及仪器准确性等原因造成较大系统误差。目前国内外尚无用 于GSNO还原酶活力检测的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的任务是优化NADH氧化法测定GSNO还原酶活力，并提供一套预先 由生产厂家称量配制和分装好，临时用只需简单操作即能使用的试剂盒。提供 灵敏、简便、不需要昂贵试剂盒设备的GSNO还原酶活力检测方法，并且样 品处理简单，可广泛用于生理病理条件下GSNO还原酶活力测定。本专利技术的技术方案是将生物样品分为两份， 一份加入含GSNO的Tris-HCl NADH溶液， 一份加入 不含GSN0的Tris-HC1 NADH溶液，37。C水浴充分反应5min后，使用磺基水 杨酸终止反应，于340nm下检测，并通过NADH的摩尔吸光系数计算NADH的变 化量，计算得出GSN0还原酶活力。本专利技术的结构为 一种GSNO还原酶活力的定量检测试剂盒，包括盒体、盒 盖和固定板，盒体内放置着试剂瓶l， 4、 5，以及EP管2和3，五个试剂瓶由 固定板分隔固定，每个试剂瓶上有说明标签，试剂瓶内封闭包装着固定重量比 配合标准称量的试剂，试剂瓶1中装有pH8.0的20mM Tris-HCl 0.5mM EDTA溶液，EP管2中装有NADH溶液，EP管3中装有GSH和NaN02固体，试剂 瓶4中装有HC1-EDTA溶液，试剂瓶5中装有磺基水杨酸EDTA溶液，EP管 3外有黑色塑料袋包装，试剂瓶l， 4和5均为白塑料瓶。本GSNO还原酶活力定量检测试剂盒的盒体和盒盖用硬纸或薄塑料板制 作，固定板用塑料泡沫板制作。使用本专利技术时，操作者按照试剂盒说明书操作使用，就可以测定各类细胞 样品GSNO还原酶活力水平。本专利技术简化了实验操作中的很多繁杂步骤，能 节约实验者时间，较好地满足实验操作的简单化和提高实验结果的准确性。附图说明图l: GSNO还原酶活力定量检测试剂盒结构中序号标示1、 4和5为试剂瓶，2和3为1.5mL EP管，6为固定板， 7为盒体，8为盒盖。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的构成与使用方法，作进一步的详细说明 检测试剂盒的构成试剂瓶1:白色塑料瓶，瓶内封闭包装pH8.0的20mM Tris-HCl 0.5mM EDTA溶液。准确称取1.576g Tris-HC1， 0. 093g EDTA，充分溶解于500mL双蒸馏 水中，使用NaOH调节pH为8. 0，此为试剂I。EP管2:普通EP管，管内封闭包装含O. 01526g NADH，此为试剂II。 EP管3:黑色塑料袋包装EP管，管内封闭包装O. 0614gGSH和0. 0138gNaOH，保持管内干燥，此为试剂ni。试剂瓶4:白色塑料瓶，瓶内封闭包装O. 5MHC1EDTA溶液。准确称取0. 0093g EDTA，溶解于50mL 0. 5M HC1中，此为试剂IV。试剂瓶5:白色塑料瓶，瓶内封闭包装5%磺基水杨酸EDTA溶液，准确称取0. 0186g EDTA， 5g磺基水杨酸，溶于100mL双蒸馏水中，得到0. 1M Na腦2标 准溶液，此为试剂V。上述三个试剂瓶和两个EP管一同放入一个由硬纸材料制成的长方形盒子 7中，并用带有圆孔的塑料泡沫板7固定各试剂瓶，然后用盒盖8盖好加封。 本检测试剂盒的使用方法，检测步骤1. 将试剂II加入lmL试剂工，振荡使试剂溶解，此为NADH溶液。2. 将试剂IV用冰浴预冷，取lmL试剂IV加入EP管3，充分振荡，使试剂全部 溶解于HC1中，冰上避光反应40min，然后用NaOH调节pH至7. 0，此为GSNO 溶液，可以4。C避光保存7天左右。GSNO储存液配制成功后，将原液稀释 2000倍，即取lpL GSNO溶液溶解于2mL试剂I中，使用lcm比色杯，在334nm 下检测产物，得到吸光值A，并使用摩尔吸光系数^900/M/cm计算得到的 GSNO浓度，其计算公式为GSVO浓度(M) =-^-x2000 。900/M/cwxlcm3. 取组织块O. lmg，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，用PBS 或者生理盐水作为匀浆介质，将组织在冰水浴中制成10%的组织匀浆。将制 备好的10%组织匀浆于6000转/min离心5min，取上清液。培养细胞使用超 声波破碎，6000转/min离心5min后取上清液用于检测。如果样品为血清， 肺泡灌洗液等，此步骤可以省略。4. 取两只试管，其中测定管加入10^iL试剂n， 200nMGSN0 (根据得到的GSNO 溶液浓度加样)，以试剂I补齐到900pL;对照管加入10^试剂n， 890 试剂I，于37度水域下反应2min。5. 在测定管和对照管中同时加入100!iL上清液，37。C下反应5min。6. 在测定管和对照管中同时加入500nL磺基水杨酸终止反应，6000转/min离 心5min，取上清液。7. 使用O. 5cm比色杯，在340nm下检测测定管和对照管NADH的变化。8. 利用NADH的摩尔吸光系数s二6220/M/cm。9. 计算G57VO还原酶活力("M / min/附g/ ra.)=(测定管吸光值-对照管吸光值)1500 ，■■ _^_ -x-xlOOOOOOnM/Mx-6220/M/cmx0.5cm 100 5minxmgpro.。权利要求1、一种GSNO还原酶活力定量检测试剂盒，包括盒体(7)、盒盖(8)和固定板(6)，其特征是盒体内放置着试剂瓶(1，4、5)和EP管(2、3)，三个试剂瓶和两个EP管由固定板(6)分隔固定，每个试剂瓶上有说明标签，试剂瓶内密封包装着固定重量配比和准确称量的试剂，试剂瓶(1)中装有pH8.0的20mM Tris-HCl 0.5mM EDTA溶液，EP管(2)中装有NADH溶液，EP管(3)中装有GSH和NaNO2固体，试剂瓶(4)中装有HCl-EDTA溶液，试剂瓶(5)中装有磺基水杨酸EDTA溶液，EP管(3)外有黑色塑料袋包装，试剂瓶(1，4，5)均为白塑料瓶。2、 如权利要求1所述GSNO还原酶活力定量检测试剂盒，其特征 是盒体(7)和盒盖(8)用硬纸或薄塑料板制成，固定板(6)用塑料 泡沫板制成。全文摘要一种GSNO还原酶活力定量检测试剂盒，包括盒体(7)、盒盖(8)和固定板(6)，盒体内放置着试剂瓶(1，4、5)和EP管(2、3)，三个试剂瓶和两个EP管由固定板(6)分隔固定，每个试剂瓶上有说明标签，试剂瓶内密封包装着固定重量配比和准确称量的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ＧＳＮＯ还原酶活力定量检测试剂盒，包括盒体（７）、盒盖（８）和固定板（６），其特征是盒体内放置着试剂瓶（１，４、５）和ＥＰ管（２、３），三个试剂瓶和两个ＥＰ管由固定板（６）分隔固定，每个试剂瓶上有说明标签，试剂瓶内密封包装着固定重量配比和准确称量的试剂，试剂瓶（１）中装有ｐＨ８．０的２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液，ＥＰ管（２）中装有ＮＡＤＨ溶液，ＥＰ管（３）中装有ＧＳＨ和ＮａＮＯ↓［２］固体，试剂瓶（４）中装有ＨＣｌ－ＥＤＴＡ溶液，试剂瓶（５）中装有磺基水杨酸ＥＤＴＡ溶液，ＥＰ管（３）外有黑色塑料袋包装，试剂瓶（１，４，５）均为白塑料瓶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曹毅，杨旭，吴凯，丁书茂，袁均林，
申请(专利权)人：华中师范大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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