【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子标记，一种茶树抗寒性相关基因erf1的snp位点、caps分子标记及其应用。
技术介绍
1、茶树 ( camellia sinensis) 是一种多年生常绿木本植物，主要生长在热带和亚热带地区，最适生长温度为20～25 ℃左右。近年来随着早生茶树品种的广泛种植和气候变化的不断加剧, 春季“倒春寒”天气也成为制约着茶产业可持续发展的不利因素。因此提高茶树抗寒性以及培育抗寒性强的茶树品种是本领域研究的重要目标。
2、随着分子生物学的发展，植物抗寒性分子机制研究取得很大进展，在不同植物品种中已筛选出一系列与抗寒相关的基因，并开发了与抗寒性相关基因紧密连锁的分子标记。caps分子标记是酶切扩增多态性序列标记方法，是将特异性扩增与限制性酶切相结合用以检测多态性的一种技术，具有共显性、位点特异性、成本低和操作简易等优点。该标记原理为，基因组片段上碱基的突变会引起限制性内切酶识别位点的改变，利用特异性引物扩增含突变位点的基因组片段，再用相应限制性内切酶消化扩增产物，结果会出现部分基因型扩增片段可被完全酶切呈2条带，部分基因型扩增片段不被酶切或酶切不完全呈1条或3条带的情况，从而产生多态性，其结果可通过琼脂糖凝胶电泳直观地表现出来。目前caps分子标记已广泛应用于黄麻( corchorus capsularis l.)、水稻( oryza sativa l.)、玉米( zea may
技术实现思路
1、针对现有技术中的不足，本专利技术提供了一种茶树抗寒性相关基因erf1的snp位点、caps分子标记及其应用，以解决现有技术中筛选茶树抗寒新品种周期长及现有分子标记存在带型不稳定，特异性不强的问题，达到为茶树抗寒性品种分子辅助育种提供标记的目的。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术的目的之一在于提供一种茶树抗寒性相关基因erf1的snp位点，所述snp位点位于茶树7号染色体第221281848位碱基，碱基多态性为c/t，所述snp位点为chr07:221281848_c/t。
4、专利技术人以‘铁观音’基因组为参考基因组，通过snp calling获得erf1基因的分子变异数据，利用r软件将分子变异数据与茶树品种的抗寒表型数据相关联，在 erf1基因编码区获得了1个与茶树抗寒性状显著关联的非同义突变位点（chr07:221281848_c/t）。
5、本专利技术的目的之二在于提供一种茶树抗寒性相关基因erf1的caps分子标记，所述caps分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，上述snp位点位于所述核苷酸序列的第155位。
6、经实验验证比对，该非同义snp位点存在c碱基时，扩增片段只能被taqi酶切，当该snp突变为t碱基则不能被酶切，选择位于taqi的酶切位点的snp位点前、后大约500bp碱基序列转化为caps标记，caps标记的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7、本专利技术的目的之三在于提供扩增上述caps分子标记的引物，所述引物的序列如下：
8、正向引物序列：5 '- ttagaatccaagctcctcctagact -3 '（seq id no.2）；
9、反向引物序列：5 '- agtacaccaatgagtgtggtgaag-3 '（seq id no.3）。
10、本专利技术的目的之四在于提供一种使用上述caps分子标记和引物的检测方法，包括以下步骤：
11、（1）提取待测茶树样本dna；
12、（2）以待测茶树样本dna为模板，利用上述引物进行pcr扩增，得到扩增产物；
13、（3）利用限制性内切酶taqi对扩增产物酶切后电泳，得待测茶树样本电泳带型；
14、（4）带型比对与鉴定：若电泳带型为2条带，则待测茶树样本为snp位点为c，基因型为cc，鉴定待测茶树样本为抗寒性强的低温耐受品种； 若电泳带型为3条带，则待测茶树样本为snp位点为杂合突变，基因型为ct，鉴定待测茶树样本为抗寒性中等的其他品种；若电泳带型为1条带，则待测茶树样本为snp位点为t，基因型为tt，鉴定待测茶树为样本抗寒性弱的低温敏感品种。
15、进一步地，每份步骤（2）中所述pcr扩增的反应体系包括：正向引物1μl，反向引物1μl，模板dna 1μl， 2×rapid taq master mix 10μl， ddh2o 7μl。
16、进一步地，步骤（2）中所述pcr扩增的反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸5min；4 ℃保存。
17、进一步地，每份步骤（3）中酶切体系包括扩增产物3μl，taqi 0.5μl，10×fastdigest green buffer 1μl，ddh2o 5.5μl；酶切条件为65℃孵育35min。
18、进一步地，步骤（4）中电泳带型为2条带时，条带片段大小分别为383bp、156bp；电泳带型为3条带时，条带片段大小分别为539bp、383bp、156bp；电泳带型为1条带时，条带片段大小为539bp。
19、本专利技术的目的之五在于提供并要求保护上述snp位点、caps分子标记、引物在茶树抗寒性鉴定分型以及辅助选择育种中的应用。
20、本专利技术的目的之六在于提供并要求保护上述检测方法在茶树抗寒性鉴定分型以及辅助选择育种中的应用。
21、本专利技术涉及一种茶树抗寒性相关基因erf1的snp位点、caps分子标记及其应用，属于分子标记
为了加速耐寒茶树种质创制与品种培育，本专利技术利用茶树群体重测序数据和基于snp的caps分子标记，分析突变位点的限制性酶切位点，筛选到特异性的内切酶taqi，通过酶切 pcr产物、琼脂糖凝胶电泳、酶切片段分析等过程，对不同茶树品种进行了纯合（tt）、杂合（ct）和野生型（cc）酶切分型。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
22、1. 本专利技术在erf1基因编码区获得了1个与茶树抗寒性状显著关联的非同义突变位点（chr07:221281848_c/t），开发出与抗寒性状紧密连锁的snp-caps分子标记，对本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种茶树抗寒性相关基因ERF1的SNP位点，其特征在于，所述SNP位点位于茶树7号染色体第221281848位碱基，碱基多态性为C/T，所述SNP位点为Chr07:221281848_C/T。
2.一种茶树抗寒性相关基因ERF1的CAPS分子标记，其特征在于，所述CAPS分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述核苷酸序列包含权利要求1所述的SNP位点。
3.扩增权利要求2所述的CAPS分子标记的引物，其特征在于，所述引物的序列如下：
4.一种使用权利要求2所述CAPS分子标记的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，每份步骤（2）中所述PCR扩增的反应体系包括：正向引物1μL，反向引物1μL，模板DNA 1μL， 2×Rapid Taq Master Mix 10μL，ddH2O 7μL。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，每份步骤（3）中酶切体系包括扩增产物3μL，TaqI 0.5μL，10× FastDigest Green Buffer 1μL，ddH2O 5.5μL；酶切条件为65℃孵育35min。
8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤（4）中电泳带型为2条带时，条带片段大小分别为383bp、156bp；电泳带型为3条带时，条带片段大小分别为539bp、383bp、156bp；电泳带型为1条带时，条带片段大小为539bp。
9.权利要求1所述的SNP位点或权利要求2所述的CAPS分子标记或权利要求3所述的引物在茶树抗寒性鉴定分型以及辅助选择育种中的应用。
10.权利要求4-8任一项所述的检测方法在茶树抗寒性鉴定分型以及辅助选择育种中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种茶树抗寒性相关基因erf1的snp位点，其特征在于，所述snp位点位于茶树7号染色体第221281848位碱基，碱基多态性为c/t，所述snp位点为chr07:221281848_c/t。
2.一种茶树抗寒性相关基因erf1的caps分子标记，其特征在于，所述caps分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述核苷酸序列包含权利要求1所述的snp位点。
3.扩增权利要求2所述的caps分子标记的引物，其特征在于，所述引物的序列如下：
4.一种使用权利要求2所述caps分子标记的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，每份步骤（2）中所述pcr扩增的反应体系包括：正向引物1μl，反向引物1μl，模板dna 1μl， 2×rapid taq master mix 10μl，ddh2o 7μl。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述pc...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘硕谦，苏芹，田娜，胡梦迪，刘仲华，黄建安，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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