【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及虾青素合成，具体为一种强化解脂耶氏酵母合成虾青素的方法。
技术介绍
1、虾青素是目前经济价值和应用价值较高的类胡萝卜素物质，由于其多方面的生理功能而引起人们极大重视。其是一种暗红棕色粉末，为脂溶性物质，不溶于水，可溶于有机溶剂。虾青素是典型的四萜化合物，由8个异戊二烯单元连接而成，两端成环，共有11个共轭双键，是类胡萝卜素典型的碳链结构，特点是在其两端不饱和环上还分别具有一个羰基和一个羟基，此结构是虾青素具有超强抗氧化活性的基础，虾青素是类胡萝卜素中抗氧化能力最强的，在淬灭活性氧、清除自由基等方面的能力是β－胡萝卜素的10倍，维生素e的百倍以上，所以虾青素不仅可以作为一种色素添加剂，还具有抗衰老、抗氧化、预防心脑血管疾病、抗肿瘤治疗疾病等多种不同的生物化学活性作用，在制药、食品和化妆品企业行业发展中深受青睐，具有非常广阔的应用研究前景。
2、目前国内外制备虾青素的方法主要可以分为两类：化学合成法和生物合成法，化学合成虾青素分为全合成法和半合成法，生物合成法又分为微生物发酵法和天然提取法，其中微生物发酵法是目前生产虾青素的主要方法，然而随着市场对虾青素的需求持续增长，目前所采用的合成方法其产量难以满足需求，因此继续一种能够显著提高虾青素产量的合成方法。
技术实现思路
1、(一)解决的技术问题
2、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种强化解脂耶氏酵母合成虾青素的方法，具备虾青素产量显著提高的优点，解决了目前所采用的合成方法其产量难以满足需求的问
3、(二)技术方案
4、本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种强化解脂耶氏酵母合成虾青素的方法，利用合成生物学的方法在解脂耶氏酵母po1f菌株中引入外源虾青素合成途径，得到高产虾青素的解脂耶氏酵母菌株(ylast3)，然后通过分别添加双氧水和acetic acid两种氧化物质到菌株ylast3中，使细胞造成氧化损伤，最后通过表达来自于黑猩猩(pantroglodytes)的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase)基因来实现缓解细胞氧化损伤同时提升虾青素的产量，具体方法如下：
5、s1、glutamine synthetase基因的过表达
6、puc19-lh-ptef-gs-cyc1-rh的构建：首先以puc57-gs为模板，gs-f/gs-r为引物扩增出带有同源片段的gs基因，以puc19空载为模板，puc19-f/puc19-r为引物，通过pcr扩增获得带有同源片段的puc19片段，以puc57-pt为模板，分别以p-f/p-r和t-f/t-r为引物扩增出带有同源片段的tef和cyc1基因，以解脂耶氏酵母po1f基因组为模板，分别以lh-f/lh-r和rh-f/rh-r为引物扩增出带有同源片段的lh和rh基因片段，将上述获得的片段：线性化puc19、tef、gs、cyc1、lh和rh，经gibson assembly组装可获得gs表达簇；
7、pcrispr1yl-mfe1质粒的构建：以pcrispr1yl-trp为模板，分别用内切酶aatii和nsii进行双酶切，得到pcrispr1yl-mfe1的载体骨架，通过引物nsii-f/mfe1-n20-r和aatii-r/mfe1-n20-f分别获得mfe1-n20-1和mfe1-n20-2片段，后经过overlap得到mfe1-n20片段，最后pcrispr1yl-mfe1载体骨架和mfe1s-n20片段经gibson assembly组装可获得pcrispr1yl-mfe1质粒；
8、解脂耶氏酵母的感受态制备和转化按照zymogen frozen-ez yeasttransformation kit ii试剂盒说明书进行，转化后挑取单菌落进行验证，获得将glutamine synthetase基因插入到mfe1位点的菌株；
9、s2、氧化损伤
10、将含有外源glutamine synthetase基因的ylast3菌株分别在含有0.5％～4.1％乙酸(c＝1mol/l)和0.2％～0.8％过氧化氢(c＝1mol/l)的ypd培养基中培养，使细胞造成氧化损伤，后通过表达外源的glutamine synthetase基因来修复氧化损伤，并检测虾青素的产量；
11、s3、摇瓶发酵
12、将单个重组菌落接种于3ml ypd液体培养基中，30℃ 220rpm振荡培养16-24h，取500μl菌液至50ml ypd液体培养基，30℃ 220rpm振荡培养120h后，结束发酵培养，采取样品；
13、s4、虾青素的提取
14、取100μl发酵液于1.5ml离心管中，12000rpm离心3min，弃上清，加入500μldmso，吹打混匀，旋涡振荡30s，65℃避光保存10min，加入500μl丙酮，旋涡振荡30s，65℃避光保存15min，12000rpm离心3min，萃取至菌体为白色时取上清，用0.22μm滤膜过滤，进行hplc检测；
15、s5、虾青素产量的检测
16、检测波长为470nm，流动相的流速是1ml/min，检测过程中用到三种流动相，分别是：a流动相为纯乙腈，b流动相为90％乙腈，c流动相为甲醇：异丙醇＝3：2，在检测样品的前后，使用流动性a冲洗柱子30min，具体的检测条件为：0min-15min：0％-90％流动相c，100％-10％流动相b，15min-27min：90％流动相c，10％流动相b，27min-28min：90％-0％流动相c，10％-100％流动相b，28min-35min，0％流动相c，100％流动相b。
17、本专利技术的有益效果是：
18、该强化解脂耶氏酵母合成虾青素的方法，主要利用双氧水(h2o2)和乙酸(aceticacid)两种物质添加到产虾青素的解脂耶氏酵母(ylast3)细胞中造成细胞氧化损伤，然后通过表达外源的黑猩猩(pan troglodytes)谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase)基因来实现缓解细胞氧化损伤，同时能够显著提升虾青素的产量，即在解脂耶氏酵母po1f中构建外源虾青素的生物合成途径，获得高产虾青素的解脂耶氏酵母菌株ylast3。然后通过外加双氧水和乙酸使菌株ylast3造成细胞氧化损伤，最后通过表达来自于黑猩猩的谷氨酰胺合成酶(gs)基因来修复细胞的氧化损伤，同时使虾青素的产量显著提升。
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1.一种强化解脂耶氏酵母合成虾青素的方法，其特征在于：利用合成生物学的方法在解脂耶氏酵母po1f菌株中引入外源虾青素合成途径，得到高产虾青素的解脂耶氏酵母菌株(YLAST3)，然后通过分别添加双氧水和Acetic acid两种氧化物质到菌株YLAST3中，使细胞造成氧化损伤，最后通过表达来自于黑猩猩(Pan troglodytes)的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase)基因来实现缓解细胞氧化损伤同时提升虾青素的产量，具体方法如下：
【技术特征摘要】
1.一种强化解脂耶氏酵母合成虾青素的方法，其特征在于：利用合成生物学的方法在解脂耶氏酵母po1f菌株中引入外源虾青素合成途径，得到高产虾青素的解脂耶氏酵母菌株(ylast3)，然后通过分别添加双氧水和acetic acid两种氧...
【专利技术属性】
技术研发人员：林博，苏愉，吴伟斌，
申请(专利权)人：广东筑美生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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