一种高效羟基化的重组人源制造技术

本申请提供一种高效羟基化的重组人源

【技术实现步骤摘要】
一种高效羟基化的重组人源III型胶原蛋白
α
1链的序列的方法


[0001]本专利技术涉及重组人源
III
型胶原蛋白及其高效羟基化的改造方法
，尤其涉及一种高效羟基化的重组人源
III
型胶原蛋白
α1链的序列的方法
。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是一种功能性结构蛋白，广泛分布于人和动物结缔组织的细胞外基质
(ECM)
中，占全身蛋白质总量的
30
％，是人体内最丰富的蛋白质家族之一
。
胶原蛋白由3条
α
‑
多肽链相互盘绕成右手三螺旋，然后以
1/4
交错
、
平行排列方式组装，形成胶原蛋白
‑
胶原纤维的超分子聚集结构
。
胶原蛋白在维持正常生理功能
、
修复损伤
、
影响细胞附着和增殖等多种生物学功能中发挥着不可或缺的作用
。
所有类型的胶原蛋白都具有三螺旋结构域，其中
(Gly
‑
X
‑
Y)n
三肽重复序列是螺旋区域的主要特征
。
[0003]由于胶原蛋白种类繁多，通常将常见的胶原蛋白类型分为Ⅰ型
、Ⅱ型
、Ⅲ型
、
Ⅴ
型和
Ⅺ
型等胶原蛋白
。
其中
III
型胶原蛋白在血管
、
>肠道和皮肤中含量丰富，在生物体的生长和伤口愈合过程中发挥重要作用，在伤口愈合过程中，
III
型胶原蛋白诱导炎症细胞和成纤维细胞迁移至伤口部位，促进结缔组织形成和恢复
。III
型胶原蛋白也是一种天然止血材料，可以诱导血小板粘附和聚集到出血部位，并激活凝血级联反应中的一些凝血因子
。
在整容手术中
III
型胶原蛋白通常用来充当皮肤填充剂，以治疗皱纹和皮肤老化，还可作为烧伤患者的康复辅助工具，也能用于骨骼重建以及各种牙科
、
整形外科和外科手术以达到人工修复效果
。
[0004]目前市场上的胶原蛋白产品大多是从哺乳动物的组织器官和结缔组织中提取，需要耗费大量原材料这无疑会对动物养殖和环境保护造成巨大影响，且提取的胶原蛋白中可能存在诸如朊病毒
、HIV、
口蹄疫病毒等病原体污染的风险
。
因此，目前迫切需要找到一种安全可靠的胶原蛋白生产方式，而基因工程技术作为一种新型方法，由于具有生产周期短
、
生产成本低
、
能快速放大规模等优点，基因工程重组表达胶原蛋白技术可以大大缓解动物养殖和环境保护等方面的压力，基因工程技术生产胶原蛋白的基因可以来源于任何哺乳动物，且对来源的基因改造后可以在大肠杆菌
、
酵母细胞和动物细胞等模式生物中表达，且经过高密度发酵后可以获得大量的胶原蛋白产品，可以有效解决胶原蛋白大规模生产的瓶颈问题
。
重组胶原蛋白具有人源胶原蛋白相同的性质，并且重组胶原蛋白具有水溶性强
、
生物活性高
、
无免疫源性低和生物相容性高的优点
。
目前对于重组胶原的制备的报道有很多，主要集中在人源胶原基因的表达，如中国专利
CN112552393B
公开了一种重组人源
III
型胶原蛋白及其毕赤酵母重组表达系统，用毕赤酵母
GS115
诱导发酵
40
‑
50h
胶原蛋白产量可达4～
5g/L
；中国专利
CN101200718B
公开了一种类人胶原蛋白基因
、
其不同重复数的同向串联基因
、
含有串联基因的重组质粒及制备方法，该方法对类人源胶原蛋白基因进行重复3～6次后分别在大肠杆菌和毕赤酵母中进行表达，但其发酵后胶原蛋白的产量和
SDS
‑
PAGE
蛋白电泳图都没提供；中国专利
CN111363029A
公开了一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白
、
表达菌株及其
构建方法，其所构建的重组胶原蛋白含有
498
个氨基酸，理论分子量为
54.5kDa
，重组胶原蛋白结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分
100
％相同，并以此为基础，成功开发出来多种医疗器械产品
。
中国专利
CN111647089A
公开了一种重组人
III
型胶原蛋白及其制备方法和应用，通过短重复氨基酸序列串联
(
重复3～
10
次
)
构成目的蛋白多肽序列，具有较好的稳定性能，催化活性较单一原始片段保持更久
。
[0005]中国专利
201110327865.5
构建了一种重组人源胶原蛋白的巴氏毕赤酵母基因工程菌，基因工程菌经发酵培养得到重组人源胶原蛋白，发酵周期为
136
小时，蛋白表达量为
16g/L
，发酵水平为
0.118g/L
·
h
，蛋白表达量虽有提高，但是发酵周期过长，发酵水平较低
。
并且在实际生产中，产物在发酵末期出现降解现象，有的批次甚至会降解至
3g/L。
因此获得稳定性更高的重组人源胶原蛋白仍然是本领域不断追求的目标
。

技术实现思路

[0006]本申请提供一种高效羟基化的重组人源
III
型胶原蛋白
α1链的序列的方法及其制备工艺
。
[0007]为了克服现有技术的不足和缺点，本专利技术提供一种简单有效的巴斯德毕赤酵母
GS115
分泌表达一种高效羟基化的重组人源
III
型胶原蛋白
α1链的序列的方法，在羟脯氨酸羟化酶前引入来源于人人源
CCAAT
结合蛋白的
REBPB
的增强子可以使羟脯氨酸酶的表达量更高，细胞内更多脯氨酸羟化酶可以使重组人源
III
型胶原蛋白形成三螺旋结构更牢固，进而促进天然结构胶原分子到胶原纤维的自组装，使重组胶原蛋白具有更好的稳定性，经巴斯德毕赤酵母
GS115
分泌表达生产出的胶原蛋白产量更高，稳定性更好，发酵后期蛋白降解现象显著降低等现象
。
[0008]一种高效羟基化的重组人源
III
型胶原蛋白
α1链的序列的方法，其特征在于，将来源于人全长Ⅲ型胶原蛋白
α1链的一段序列
(NCBI
序列号：
NP_000081.2)
，其序列位于人全长Ⅲ型胶原蛋白
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种高效羟基化的重组人源
III
型胶原蛋白
α1链的序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、
选择合适的宿主菌
、
合适的胶原蛋白基因片段
、
合适来源的增强子基因以及合适来源的脯氨酸羟化酶基因；
S2、
通过
PCR
技术对表达载体
pPIC9K、
胶原蛋白片段
ReCOL3A1
‑
8、
增强子基因片段和脯氨酸羟化酶基因片段进行克隆；
S3、
制备
Pichia pastoris GS115
感受态细胞
。2.
根据权利要求1所述的一种高效羟基化的重组人源
III
型胶原蛋白
α1链的序列的方法，其特征在于，所述宿主菌为巴斯德毕赤酵母
GS115(Pichia pastoris GS115),
所述的胶原蛋白片段
ReCOL3A1
是来源于人全长Ⅲ型胶原蛋白
α1链的一段序列
(NCBI
序列号：
NP_000081.2)
，其序列位于人全长Ⅲ型胶原蛋白
α1链氨基酸序列的第
168
至
289
位氨基酸序列，并重复8次，得到胶原蛋白片段
ReCOL3A1
‑8；所述的增强子基因片段是来源于人源
CCAAT
结合蛋白的
REBPB(NCBI
序列号：
NP_001272808.1)
；所述的脯氨酸羟化酶
(P4H)
基因序列是来源从草履虫小球藻病
1(PBCV
‑
1)
的脯氨酸羟化酶
(P4H)
基因序列
(NCBI
序列号：
NP048433.1)。3.
根据权利要求1所述的一种高效羟基化的重组人源
III
型胶原蛋白
α1链的序列的方法，其特征在于，所述的胶原蛋白氨基酸序列片段
、
人源
CCAAT
结合蛋白的
REBPB
增强子序列和草履虫小球藻病毒1脯氨酸羟化酶序列片段经过密码子优化后进行合成，胶原蛋白对应的氨基酸序列为
SEQ ID NO.1
所示，胶原蛋白对应的核苷酸序列为
SEQ ID NO.2
所示；人源
CCAAT
结合蛋白的
REBPB
增强子对应的核苷酸序列为
SEQ ID NO.3
；草履虫小球藻病毒
1(PBCV
‑
1)
的脯氨酸羟化酶
(P4H)
对应的氨基酸序列为
SEQ ID NO.4
所示，草履虫小球藻病毒
1(PBCV
‑
1)
的脯氨酸羟化酶
(P4H)
对应的核苷酸序列为
SEQ ID NO.5
所示
。4.
根据权利要求1所述的一种高效羟基化的重组人源
III
型胶原蛋白
α1链的序列的方法，其特征在于，步骤
S2
中克隆方面包括：
S2
‑
1、
通过使用
PCR
技术并分别使用引物
pPIC9K
‑
F/R、ReCOL3A1
‑8‑
F/R、REBPB
‑
F/R
和
PBCV
‑
P4H
‑
F/R(SEQ ID NO.6)
对表达载体
pPIC9K、
胶原片段
ReCOL3A1
‑
8、REBPB
增强子片段和草履虫小球藻病毒
1(PBCV
‑
1)
的脯氨酸羟化酶
(P4H)
基因序列进行
PCR
克隆来获取连接片段，将克隆得到的胶原蛋白
ReCOL3A1
‑
8、REBPB
增强子片段
、
草履虫小球藻病毒
1(PBCV
‑
1)
的脯氨酸羟化酶
(P4H)
片段和表达载体
pPIC9K
片段分别按照浓度比为
3:4:2:1
混合；
S2
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：林博，李柳宏，吴伟斌，
申请(专利权)人：广东筑美生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：