一种高效羟基化的重组人源制造技术

本申请提供一种高效羟基化的重组人源

【技术实现步骤摘要】
一种高效羟基化的重组人源III型胶原蛋白
α
1链的序列的方法


[0001]本专利技术涉及重组人源
III
型胶原蛋白及其高效羟基化的改造方法
，尤其涉及一种高效羟基化的重组人源
III
型胶原蛋白
α1链的序列的方法
。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是一种功能性结构蛋白，广泛分布于人和动物结缔组织的细胞外基质
(ECM)
中，占全身蛋白质总量的
30
％，是人体内最丰富的蛋白质家族之一
。
胶原蛋白由3条
α
‑
多肽链相互盘绕成右手三螺旋，然后以
1/4
交错
、
平行排列方式组装，形成胶原蛋白
‑
胶原纤维的超分子聚集结构
。
胶原蛋白在维持正常生理功能
、
修复损伤
、
影响细胞附着和增殖等多种生物学功能中发挥着不可或缺的作用
。
所有类型的胶原蛋白都具有三螺旋结构域，其中
(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种高效羟基化的重组人源
III
型胶原蛋白
α1链的序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、
选择合适的宿主菌
、
合适的胶原蛋白基因片段
、
合适来源的增强子基因以及合适来源的脯氨酸羟化酶基因；
S2、
通过
PCR
技术对表达载体
pPIC9K、
胶原蛋白片段
ReCOL3A1
‑
8、
增强子基因片段和脯氨酸羟化酶基因片段进行克隆；
S3、
制备
Pichia pastoris GS115
感受态细胞
。2.
根据权利要求1所述的一种高效羟基化的重组人源
III
型胶原蛋白
α1链的序列的方法，其特征在于，所述宿主菌为巴斯德毕赤酵母
GS115(Pichia pastoris GS115),
所述的胶原蛋白片段
ReCOL3A1
是来源于人全长Ⅲ型胶原蛋白
α1链的一段序列
(NCBI
序列号：
NP_000081.2)
，其序列位于人全长Ⅲ型胶原蛋白
α1链氨基酸序列的第
168
至
289
位氨基酸序列，并重复8次，得到胶原蛋白片段
ReCOL3A1
‑8；所述的增强子基因片段是来源于人源
CCAAT
结合蛋白的
REBPB(NCBI
序列号：
NP_001272808.1)
；所述的脯氨酸羟化酶
(P4H)
基因序列是来源从草履虫小球藻病
1(PBCV
‑
1)
的脯氨酸羟化酶
(P4H)
基因序列
(NCBI
序列号：
NP048433.1)。3.
根据权利要求1所述的一种高效羟基化的重组人源
III
型胶原蛋白
α1链的序列的方法，其特征在于，所述的胶原蛋白氨基酸序列片段
、
人源
CCAAT
结合蛋白的
REBPB
增强子序列和草履虫小球藻病毒1脯氨酸羟化酶序列片段经过密码子优化后进行合成，胶原蛋白对应的氨基酸序列为
SEQ ID NO.1
所示，胶原蛋白对应的核苷酸序列为
SEQ ID NO.2
所示；人源
CCAAT
结合蛋白的
REBPB
增强子对应的核苷酸序列为
SEQ ID NO.3
；草履虫小球藻病毒
1(PBCV
‑
1)
的脯氨酸羟化酶
(P4H)
对应的氨基酸序列为
SEQ ID NO.4
所示，草履虫小球藻病毒
1(PBCV
‑
1)
的脯氨酸羟化酶
(P4H)
对应的核苷酸序列为
SEQ ID NO.5
所示
。4.
根据权利要求1所述的一种高效羟基化的重组人源
III
型胶原蛋白
α1链的序列的方法，其特征在于，步骤
S2
中克隆方面包括：
S2
‑
1、
通过使用
PCR
技术并分别使用引物
pPIC9K
‑
F/R、ReCOL3A1
‑8‑
F/R、REBPB
‑
F/R
和
PBCV
‑
P4H
‑
F/R(SEQ ID NO.6)
对表达载体
pPIC9K、
胶原片段
ReCOL3A1
‑
8、REBPB
增强子片段和草履虫小球藻病毒
1(PBCV
‑
1)
的脯氨酸羟化酶
(P4H)
基因序列进行
PCR
克隆来获取连接片段，将克隆得到的胶原蛋白
ReCOL3A1
‑
8、REBPB
增强子片段
、
草履虫小球藻病毒
1(PBCV
‑
1)
的脯氨酸羟化酶
(P4H)
片段和表达载体
pPIC9K
片段分别按照浓度比为
3:4:2:1
混合；
S2
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：林博，李柳宏，吴伟斌，
申请(专利权)人：广东筑美生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：