大规模制备制造技术

提供了大规模制备

【技术实现步骤摘要】
大规模制备164.88
°
三螺旋结构胶原蛋白生物方法


[0001]本专利技术涉及利用大规模生物发酵实现具有
164.88
°
三螺旋结构的胶原蛋白制备方法属于合成生物学

。

技术介绍

[0002]人有
28
种不同的胶原蛋白，胶原蛋白是人和动物体内含量最多的蛋白，占体内蛋白总量的
25
‑
30
％，约占体重的6％
。
胶原蛋白是皮肤
、
骨骼
、
牙齿
、
角膜
、
肌腱
、
韧带以及各种组织器官中存在的重要的结构蛋白，起支撑和保护机体组织的功能
。
胶原蛋白是细胞外基质的主要组分，其生物学活性主要表现在促进细胞粘附
、
生长分化
、
细胞信号通路的应答
、
血小板凝集
、
细胞和组织器官功能的维护和损伤修复等功能
。
胶原蛋白在空间结构上呈现出三股螺旋缠绕的结构，三条独立的胶原
α
肽链主要以氢键的形式缠绕形成螺旋结构
。
在体内胶原蛋白以三螺旋的结构与组织和细胞结合以发挥其生物学效应，因此胶原蛋白的生物学活性很大程度上依赖其天然的三螺旋结构
。
胶原蛋白优良的生物学活性使其在生物医学材料，医疗美容
、
化妆品等领域拥有巨大的应用价值和潜力
。/>[0003]现在市场上主要的胶原蛋白产品来源于动物组织提取，这种方法在提取的过程中破坏了天然的三螺旋结构，影响了胶原生物学活性的发挥
。
而且使用动物来源提取工艺得到的胶原蛋白其肽段分子量不均一，可加工性较差
。
由于动物胶原蛋白与人胶原蛋白在氨基酸序列上存在差异，因此可能会在临床上造成潜在的免疫原性，安全性较差
。
而且动物组织受其来源的影响需要解决动物病毒的安全隐患才能进入市场
。
随着市场对胶原蛋白产品安全性
、
有效性要求的提高，传统的从动物组织中提取胶原蛋白的方式已经无法满足现有市场的需求
。
而且，以胶原蛋白作为生物材料应用于医疗场景的产品需求量也在日益增大，需要通过别的的途径来解决目前市场上存在的问题
。
通过基因工程等分子生物学技术来生产具有天然三螺旋结构的重组胶原蛋白在解决以上所述问题方面具有极大的潜力
。
[0004]市场上已经有企业通过基因重组的方式制备
III
型胶原蛋白的产品，但是难以实现三螺旋结构，利用合成生物发酵具有正确三螺旋结构的胶原蛋白具有较高技术壁垒
。
[0005]本领域中需要合成生物发酵具有正确三螺旋结构的胶原蛋白的方法
。

技术实现思路

[0006]专利技术人发现了一种人
III
型胶原蛋白，结构研究证实，人
III
型胶原蛋白核心功能区具有
164.88
°
三螺旋结构
(CN109593126A)。
专利技术人已经通过基因重组的方式，利用大肠杆菌表达系统成功制备了重组Ⅲ型人源化胶原蛋白
。
然而，专利技术人发现大肠杆菌表达系统存在蛋白表达量有限，工艺放大受限等缺点
。
因此，专利技术人尝试以真核表达系统表达人
III
型胶原蛋白
。
经过大量前期筛选工作，专利技术人发现当以毕赤酵母表达人
III
型胶原蛋白时可以体外合成大量具有
164.88
°
三螺旋结构胶原蛋白
。
专利技术人在先前的申请中还发现人
III
型胶原蛋白在通过大肠杆菌表达时存在细菌内毒素，这增加了胶原蛋白纯化的复杂性和难度
。
专利技术人通过在酵母表达系统中表达胶原蛋白消除了该技术问题
。
[0007]本专利技术通过改造“底盘细菌”获得了大规模生产，具有
164.88
°
三螺旋结构的重组人源化胶原蛋白，属于
A
型，通过大规模生产能够满足市场需求
。
[0008]在一方面，提供了一种构建表达胶原蛋白的酵母细胞的方法，其包括将重组表达载体导入酵母细胞中，其中重组表达载体包含编码胶原蛋白的多核苷酸，所述胶原蛋白包含以
SEQ ID No.1
所示的序列的重复单元，重复单元的数目是2‑
32
，重复单元是直接连接的
。
在一个实施方案中，胶原蛋白是重组Ⅲ型人源化胶原蛋白
。
在一个实施方案中，胶原蛋白是
164.88
°
三螺旋结构胶原蛋白
。
[0009]在一个实施方案中，胶原蛋白包含
SEQ ID No.2
或3所示的氨基酸序列
。
在一个实施方案中，多核苷酸包含
SEQ ID No.4
或5所示的核苷酸序列
。
本专利技术的多核苷酸可以在酵母宿主细胞中有效表达胶原蛋白
。
[0010]在一个实施方案中，重组表达载体是酵母系统表达载体
。
在一个实施方案中，酵母系统表达载体为
pPICZ
α
A、pPIC9、pPIC9K、pHIL
‑
S1、
或
pYAM75P
载体
。
[0011]在一个实施方案中，酵母是巴斯德毕赤酵母
。
在一个实施方案中，巴斯德毕赤酵母是巴斯德毕赤酵母
X33、GS115、SMD1168、KM71
或
KM71H
菌株
。
[0012]在一个实施方案中，方法包括以下一个或多个步骤：
[0013](1)
将多核苷酸插入表达载体，优选
pPiczal
α
A
表达载体的
NotI
和
XhoI
酶切位点之间，以得到重组表达质粒；
[0014](2)
对重组表达质粒进行酶切，优选用
sac1
进行酶切；
[0015](3)
对酶切后的重组表达质粒进行纯化；
[0016](4)
通过电转化，将酶切后的重组表达质粒导入酵母细胞中
。
[0017]在另一个方面，提供了表达胶原蛋白的酵母细胞，其中所述胶原蛋白包含以
SEQ ID No.1
所示的序列的重复单元，重复单元的数目是2‑
32
，重复单元是直接连接的；酵母细胞是巴斯德毕赤酵母
。
[0018]在一个实施方案中，巴斯德毕赤酵母是巴斯德毕赤酵母
X33、GS115、SMD本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种构建表达胶原蛋白的酵母细胞的方法，其包括将重组表达载体导入酵母细胞中，其中重组表达载体包含编码胶原蛋白的多核苷酸，所述胶原蛋白包含以
SEQ ID No.1
所示的序列的重复单元，重复单元的数目是2‑
32
，重复单元是直接连接的；优选地，胶原蛋白是重组Ⅲ型人源化胶原蛋白，优选
164.88
°
三螺旋结构胶原蛋白
。2.
根据权利要求1所述的方法，其中胶原蛋白包含
SEQ ID No.2
或3所示的氨基酸序列；优选地，多核苷酸包含
SEQ ID No.4
或5所示的核苷酸序列
。3.
根据权利要求1或2所述的方法，其中重组表达载体是酵母系统表达载体，优选为
pPICZ
α
A、pPIC9、pPIC9K、pHIL
‑
S1、
或
pYAM75P
载体
。4.
根据权利要求1‑3中任一项所述的方法，其中酵母是巴斯德毕赤酵母；优选是巴斯德毕赤酵母
X33、GS115、SMD1168、KM71
或
KM71H
菌株
。5.
根据权利要求1‑4中任一项所述的方法，其包括以下一个或多个步骤：
(1)
将多核苷酸插入表达载体，优选
pPiczal
α
A
表达载体的
NotI
和
XhoI
酶切位点之间，以得到重组表达质粒；
(2)
对重组表达质粒进行酶切，优选用
sac1
进行酶切；
(3)
对酶切后的重组表达质粒进行纯化；
(4)
通过电转化，将酶切后的重组表达质粒导入酵母细胞中
。6.
表达胶原蛋白的酵母细胞，其中所述胶原蛋白包含以
SEQ ID No.1
所示的序列的重复单元，重复单元的数目是2‑
32
，重复单元是直接连接的；酵母细胞是巴斯德毕赤酵母；优选是巴斯德毕赤酵母
X33、GS115、SMD1168、KM71
或
KM71H
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玲玲，兰小宾，刘增耀，邓鹏军，张永健，刘欣，张晓波，王颖，杨霞，何振瑞，
申请(专利权)人：山西锦波生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：