一种酶转化合成脱氧胆酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，首先获得重组表达胆汁酸水解酶基因的质粒，通过重组大肠杆菌胞高效表达胆汁酸水解酶后，将期应用于转化甘氨脱氧胆酸(glycodeoxycholic acid)或牛磺脱氧胆酸盐(taurodeoxycholate)，可分别将甘氨脱氧胆酸或牛磺脱氧胆酸盐转化为甘氨酸(glycine)或牛磺酸(taurine)和脱氧胆酸的混合物，通过进一步分离获得脱氧胆酸，具有反应时间短、转化率高和制备的产品纯度高的优势，具备工业化生产应用前景。应用前景。应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种酶转化合成脱氧胆酸的方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种酶转化合成脱氧胆酸的方法。

技术介绍

[0002]脱氧胆酸(Deoxycholic acid)是一种在第7位碳原子上缺失一个羟基的胆汁酸，是胆酸失去一个氧原子而得到的一种游离胆汁酸。脱氧胆酸在胆汁中主要以牛磺脱氧胆酸盐或甘氨脱氧胆酸的形式存在。脱氧胆酸的分子式C
24
H
40
O4，熔点176
‑
178℃，易溶于乙醇，溶于丙酮、冰醋酸、碱金属氢氧化物和碱金属碳酸盐，稍溶于乙醚、氯仿，微溶于水、苯。
[0003]脱氧胆酸及脱氧胆酸盐(Deoxycholate)具有表面活性，作为化妆品和药剂中安全有效的乳化剂使用，同时具有抗真菌和抗炎作用，一般临床上也常用作利胆药。将脱氧胆酸做成针剂，注射到皮下脂肪组织时会导致脂肪细胞溶解。注射脱氧胆酸可以有效改善成人颏下脂肪相关的中度至重度凸度或饱满度的外观，这是目前唯一在美国和欧盟获准治疗下巴以下脂肪堆积的方法，所以脱氧胆酸通常多应用在医学美容领域。根据最新研究，经皮下注射的脱氧胆酸不会改变脂质如游离脂肪酸、总胆固醇或甘油三酯的组成，也不会影响脂肪因子例如白细胞介素
‑
6或
‑
15、载脂蛋白B、脂联素在人体内的临床检测水平。脱氧胆酸这种特殊的促进脂肪细胞溶解的功能和特有的安全性使其在国内和国外医学美容市场的需求量都很大。
[0004]目前脱氧胆酸及脱氧胆酸盐的合成主要以化学合成为主。常用方法以牛胆水解液加入氢氧化钠和40％水溶液于80
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90℃，搅拌后冷却至20℃，过滤，将滤液用50％硫酸在10℃调节至pH至1.5，收集沉淀用水洗至pH7
‑
7.5。将滤得的沉淀在40℃以乙酸乙酯和苯1∶1的混合溶液中搅拌，过滤去，冷却，待溶液中析出晶体即为脱氧胆酸。CN114716497A公开了一种化学合成脱氧胆酸盐的方法，主要涉及一种制备脱氧胆酸盐中间产物的合成方法。CN106083969A公开了以9α
‑
羟基雄甾
‑4‑
烯
‑
3，17
‑
二酮为起始底物，经消除反应、还原反应、witting反应等步骤制备获得脱氧胆酸及脱氧胆酸盐的方法。化学法合成过程涉及的步骤多、反应条件苛刻及催化剂要求较高。与化学合成法相比，酶转化或生物合成法发展迅速，其具有环境友好、过程无需高压催化剂等要求，污染小且产物得率高。
[0005]CN107099516A公开了一种通过重组胞外酶表达转化底物获得脱氧胆酸的方法，即通过分子进化获得活性和稳定性均提高的7β
‑
羟基甾醇脱氢酶突变体蛋白并通过异源表达获得这种重组突变体酶制剂。后将该重组突变体酶制剂应用在熊脱氧胆酸合成中，经过与固定化7α
‑
羟基甾醇脱氢酶酶法耦联，可以直接催化廉价底物鹅脱氧胆酸的差向异构，连续转化制备熊脱氧胆酸。将酶法转化用于生产脱氧胆酸，具有反应条件温和、产率高、显著降低生产成本且具有操作简单易于放大等优势。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的在于提供一种酶转化合成脱氧胆酸的方法。
[0007]本专利技术的技术路线为：
[0008]当以甘氨脱氧胆酸为底物时，反应如下：
[0009][0010]当以牛磺脱氧胆酸盐为底物时，反应如下：
[0011][0012]本专利技术的具体技术方案如下：
[0013]一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，包括如下步骤：
[0014](1)将胆汁酸水解酶的基因片段插入到pET28a载体中，获得表达质粒载体，该基因片段如SEQ ID NO：01、02或03所示；
[0015](2)将上述表达质粒载体转化入大肠杆菌中，进行扩大培养、诱导表达、细胞破碎和离心取上清，获得重组胆汁酸水解酶；
[0016](3)将上述重组胆汁酸水解酶和甘氨脱氧胆酸/牛磺脱氧胆酸盐混合进行酶促反应，再经纯化分离，获得脱氧胆酸。
[0017]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述胆汁酸水解酶的基因片段由如SEQ ID NO：04所示的Bsh
‑
F和如SEQ ID NO：05所示的Bsh
‑
R，以动物双歧杆菌的基因组DNA为模板，经PCR扩增获得。
[0018]进一步优选的，所述PCR的条件为：98℃预变性5min，98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，共25个循环。
[0019]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述胆汁酸水解酶的基因片段由如SEQ ID NO：06所示的Bsh
‑
F1和如SEQ ID NO：07所示的Bsh
‑
R1，以产气荚膜梭菌的基因组DNA为模板，经PCR扩增获得。
[0020]进一步优选的，所述PCR的条件为：98℃预变性5min，98℃变性28s，56℃退火50s，72℃延伸2min，共28个循环。
[0021]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述酶促反应的pH为6
‑
7，温度为30
‑
37℃，转速为200rpm，时间为0.5
‑
1h。
[0022]胆汁酸水解酶在酶转化合成脱氧胆酸中的应用，该胆汁酸水解酶来源于动物双歧杆菌、产气荚膜梭菌或肠乳杆菌。
[0023]在本专利技术的一个优选实施方案中，包括如下步骤：
[0024](1)将胆汁酸水解酶的基因片段插入到pET28a载体中，获得表达质粒载体，该基因片段如SEQ ID NO：01、02或03所示；
[0025](2)将上述表达质粒载体转化入大肠杆菌中，进行扩大培养、诱导表达、细胞破碎和离心取上清，获得重组胆汁酸水解酶；
[0026](3)将上述重组胆汁酸水解酶和甘氨脱氧胆酸/牛磺脱氧胆酸盐混合进行酶促反应，再经纯化分离，获得脱氧胆酸
[0027]进一步优选的，所述胆汁酸水解酶的基因片段由如SEQ ID NO：04所示的Bsh
‑
F和如SEQ ID NO：05所示的Bsh
‑
R，以动物双歧杆菌的基因组DNA为模板，经PCR扩增获得。
[0028]进一步优选的，所述胆汁酸水解酶的基因片段由如SEQ D NO：06所示的Bsh
‑
F1和如SEQ ID NO：07所示的Bsh
‑
R1，以产气荚膜梭菌的基因组DNA为模板，经PCR扩增获得。
[0029]本专利技术的有益效果是：本专利技术首先获得重组表达胆汁酸水解酶基因的质粒，通过重组大肠杆菌胞高效表达胆汁酸水解酶后，将期应用于转化甘氨脱氧胆酸(glycodeoxycholic acid)或牛磺脱氧胆酸盐(taurodeoxycholate)，可分别将甘氨脱氧胆酸或牛磺脱氧胆酸盐转化为甘氨酸(glycine)或牛磺酸(taurine)和脱氧胆酸的混合物，通过进一步分离获得脱氧胆酸，具有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)将胆汁酸水解酶的基因片段插入到pET28a载体中，获得表达质粒载体，该基因片段如SEQ D NO：01、02或03所示；(2)将上述表达质粒载体转化入大肠杆菌中，进行扩大培养、诱导表达、细胞破碎和离心取上清，获得重组胆汁酸水解酶；(3)将上述重组胆汁酸水解酶和甘氨脱氧胆酸/牛磺脱氧胆酸盐混合进行酶促反应，再经纯化分离，获得脱氧胆酸。2.如权利要求1所述的一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，其特征在于：所述胆汁酸水解酶的基因片段由如SEQ ID NO：04所示的Bsh
‑
F和如SEQ ID NO：05所示的Bsh
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R，以动物双歧杆菌的基因组DNA为模板，经PCR扩增获得。3.如权利要求2所述的一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，其特征在于：所述PCR的条件为：98℃预变性5min，98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，共25个循环。4.如权利要求1所述的一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，其特征在于：所述胆汁酸水解酶的基因片段由如SEQ ID NO：06所示的Bsh
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F1和如SEQ ID NO：07所示的Bsh
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R1，以产气荚膜梭菌的基因组DNA为模板，经PCR扩增获得。5.如权利要求4所述的一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，其特征在于：所述PCR的条件为：98℃预变性5min，98℃变性28s，56℃退火50s，72℃延伸2min，共...

【专利技术属性】
技术研发人员：林博，李悦歆，
申请(专利权)人：广东筑美生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：