使用表达雪胆三萜合成酶HcOSC6基因的工程菌制备雪胆素的方法技术

本发明专利技术涉及一种使用表达雪胆三萜合成酶HcOSC6基因的工程菌制备雪胆素的方法，属于基因工程技术领域，本发明专利技术以pYES2

【技术实现步骤摘要】
使用表达雪胆三萜合成酶HcOSC6基因的工程菌制备雪胆素的方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体的说，涉及一种使用表达雪胆三萜合成酶HcOSC6基因的工程菌制备雪胆素的方法。

技术介绍

[0002]雪胆(Hemsleya chinensis)是葫芦科、雪胆属植物。多年生攀援草本。块茎膨大，扁卵圆形，常半裸露于土面。块茎入药。雪胆素有解热毒，健脾胃，止疼痛。主治肺热咳嗽、胃溃疡、胃痛、肠炎、泌尿系统感染及其他多种感染。块茎主要药用成分是雪胆素(雪胆甲素和雪胆乙素)，味苦，因其植物中含量低且提取效率低，因此从定点突变改变雪胆素酶基因表达，提高雪胆素含量至关重要。
[0003]为了供应市场和提高雪胆素的产量，本专利技术公开了一种使用表达雪胆三萜合成酶HcOSC6基因的工程菌制备雪胆素的方法。

技术实现思路

[0004]为了克服
技术介绍
中存在的问题，本专利技术提供了一种使用表达雪胆三萜合成酶HcOSC6基因的工程菌制备雪胆素的方法。
[0005]为实现上述目的，本专利技术是通过如下技术方案实现的：
[0006]使用表达雪胆三萜合成酶HcOSC6基因的工程菌制备雪胆素的方法，其特征在于：包含以下步骤：
[0007]S1，查找NCBI序列，基于大肠杆菌中密码子偏好性进行优化并截短，从雪胆的组织中克隆出HcOSC6并设计适于大肠杆菌表达的基因，装载到pYES2质粒载体上，得到pYES2
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HcOSC6重组质粒；
[0008]S2，设计突变引物对，突变引物对为：L250A、Y336A和I551A中的一个，三对引物的序列依次如SEQ ID.1～2、SEQ ID.3～4、SEQ ID.5～6所示；
[0009]S3，以pYES2
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HcOSC6重组质粒为模板进行PCR扩增，得到突变的pYES2
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HcOSC6重组质粒，然后经过DpnI酶切反应后，将突变质粒pYES2
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L250A、pYES2
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Y336A、pYES2
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I551A转化大肠杆菌E
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.coli DH5α感受态细胞，经过Amp抗性筛选阳性克隆；
[0010]S4，突变成功的菌体平板划线，挑菌，摇菌，重提质粒，转化到GIL77酿酒酵母感受态细胞，构建工程菌GIL77/pYES2
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HcOSC6。
[0011]进一步的，所述的S3步骤中，PCR反应的反应条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，58℃退火复性30s，72℃延伸3min30s，循环35次；72℃充分延伸3min30s。
[0012]进一步的，所述的S3步骤中，PCR反应的反应体系为：
[0013][0014]进一步地，所述的S4步骤中重提质粒时的消化反应体系为：
[0015][0016]本专利技术的有益效果：使用本专利技术可快速的表达出雪胆素，为雪胆素的生产和提高产量提供了一种新的思路。
附图说明
[0017]图1是本专利技术中PCR扩增产物：突变的pYES2
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HcOSC6重组质粒的1％琼脂糖凝胶电泳图；
[0018]图2是本专利技术中工程菌GIL77/pYES2
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HcOSC6的培养实物图；
[0019]图3是本专利技术中突变体L250A，I551A，Y336A的三萜化合物产量和野生型菌株产量的比图。
[0020]图1中，泳道1
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17分别为：
[0021]1.P244A
[0022]2.E246A
[0023]3.F247A
[0024]4.W248A
[0025]5.L250A
[0026]6.F256A
[0027]7.M261A
[0028]8.Y269A
[0029]9.S273A
[0030]10.L328A
[0031]11.W329A
[0032]12.I332A
[0033]13.Y336A
[0034]14.I551A
[0035]15.P553A
[0036]16.D490E
[0037]17.C491A
[0038]M
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marker：250bp DNA ladder
[0039]光亮条带大小为790bp。
具体实施方式
[0040]为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本专利技术的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
[0041]实施例一
[0042]1.雪胆三萜合成酶HcOSC6基因
[0043]查找NCBI(National Center for Biotechnology)序列，基于大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)中密码子偏好性进行优化并截短，从雪胆的组织中克隆出HcOSC6并设计适于大肠杆菌表达的基因，装载到pYES2质粒载体上。
[0044]1.2构建突变体菌株
[0045]设计三对突变引物，突变引物分别为：
[0046]L250AS:5'TCCACCTGAATTTTGGATAGCACCTTACTTCCTACC 3'(SEQ ID.1)
[0047]L250AS:3'AGGTAGGAAGTAAGGTGCTATCCAAAATTCAGGTGG 5'(SEQ ID.2)
[0048]Y336AS:5'TCTATACACCACGTGGCAGAGCCCTTCTTTAC 3'(SEQ ID.3)
[0049]Y336A S:3'AGTAAAGAAGGGCTCTGCCACGTGGTGTATAG5'(SEQ ID.4)
[0050]I551A S:5'TCTATACACCACGTGGCAGAGCCCTTCTTTAC3'(SEQ ID.5)
[0051]I551A S:3'ACGTTTCTGCAGGGTTTGCCAACTCCAACC5'(SEQ ID.6)
[0052]快速定点突变原理：经PCR扩增目的基因，DpnⅠ酶切延伸产物。由于原来模板质粒来源于大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnⅠ敏感而被切碎(DpnⅠ识别序列为甲基化的(GmATC)，而体外合成的带突变的质粒由于没有甲基化而不被切开，即可得到突变质粒的克隆。
[0053]PCR反应体系(50μL)
[0054][0055]PCR反应条件
[0056][0057][0058]消化反应体系(50μL)
[0059][0060]以pYES2
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HcOSC6重组质粒为模板进行PCR扩增，反应条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，58℃退火复性30s，72℃延伸3min30s，循环35次；72℃充分延伸3min30s。如图1，得到突变的pYES2
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.使用表达雪胆三萜合成酶HcOSC6基因的工程菌制备雪胆素的方法，其特征在于：包含以下步骤：S1，查找NCBI序列，基于大肠杆菌中密码子偏好性进行优化并截短，从雪胆的组织中克隆出HcOSC6并设计适于大肠杆菌表达的基因，装载到pYES2质粒载体上，得到pYES2
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HcOSC6重组质粒；S2，设计突变引物对，突变引物对为：L250A、Y336A和I551A中的一个，三对引物的序列依次如SEQ ID.1~2、SEQ ID.3 ~4、SEQ ID.5~6所示；S3，以pYES2
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HcOSC6重组质粒为模板进行PCR扩增，得到突变的pYES2
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HcOSC6重组质粒，然后经过DpnI酶切反应后，将突变质粒pYES2
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L250A、pYES2
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Y336A、pYES2
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I551A转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，经过Amp抗性筛选阳性克隆；S4，突变成功的菌体平板划线，挑菌，摇菌，重提质粒，转化到GIL77酿酒酵母感受态细胞，构建工程菌GIL77/pYES2
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HcOSC6。2.根据权利要求1所述的使用表达雪胆三萜合成酶HcOSC6基因的工程菌制备雪胆素的方法，其特征在于：所述的S3步骤中，PCR反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵艳，李霞，翟晨曦，高青青，向春繁，袁成晓，梁艳丽，杨生超，张广辉，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：