一种醋酸可的松的微生物发酵制备方法技术

本发明专利技术涉及一种醋酸可的松的微生物发酵制备方法，所述方法包括：将含有3

【技术实现步骤摘要】
一种醋酸可的松的微生物发酵制备方法
(一)

[0001]本专利技术涉及一种醋酸可的松的微生物发酵制备方法。
(二)
技术介绍

[0002]2016年全球甾体激素药物销售额超过1000亿美金，是仅次于抗生素的第二大类化学药。目前，我国已经把甾体激素药物新资源开发作为医药行业近期发展的方向和重点之一。相比于传统工艺路线，采取微生物发酵的生物技术路线生产甾体，以自然界内广泛存在的甾醇为原料，生产工艺和生产过程环境污染小，减轻了行业的资源浪费问题，消除了环保压力，而且节约了成本，促进了可持续发展。但由于底物溶解性差，微生物(酶)活性难以提高等因素的影响，导致转化周期长，转化率低，分离纯化难度较大，收率难以提高。其中节杆菌过厚的细胞膜被认为是阻碍甾体传质的一个重要原因。高浓度底物转化率低下，而且杆菌具有不同寻常的细胞外膜，这种膜具有极低的渗透性，导致菌株对甾体的转运能力低下。鉴于此，有必要对其进行改进。
(三)
技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种醋酸可的松的微生物发酵制备方法，有效提高产物的转化率，提高收率。
[0004]本专利技术采用的技术方案是：
[0005]一种醋酸可的松的微生物发酵制备方法，所述方法包括：将含有3
‑
甾酮
‑1‑
脱氢酶的微生物接种至发酵培养基，加入底物醋酸可的松，并添加细胞壁干扰剂和表面活性剂，进行微生物发酵，发酵完成后，于发酵液中获得所述醋酸可的松；所述细胞壁干扰剂为下列之一：青霉素G钠，DL
‑
正亮氨酸，杆菌肽，甘氨酸。
[0006]优选的，所述含有3
‑
甾酮
‑1‑
脱氢酶的微生物为简单节杆菌(Arthrobacter simp lex)CPCC 140451。
[0007]所述表面活性剂优选为吐温
‑
80，添加量为0.5～1mL/L。
[0008]优选的，所述底物醋酸可的松添加量为5～20g/,L。在生物转化时，可以将所述醋酸可的松分次投加到所述发酵培养液中，采用分次投加的方式能够避免一次投料后底物对菌种的毒毒害作用，更加有利于醋酸可的松的转化。分次投加的次数不作严格根制，具体可以为2～5次，例如4次，进一步地，可以控制相邻两次投加之间的时间间隔为3～10h。
[0009]简单节杆菌的培养方法为：
[0010](1)斜面培养
[0011]所述斜面培养基组成如下：葡萄糖8～10g/L，酵母膏5～10g/L，玉米浆5～10g/L，磷酸二氢钾2～5g/L，pH7.0
‑
8.0，琼脂10～20g/L，121℃灭菌20min，接种简单节杆菌菌种，25～32℃恒温培养箱培养1～6天。
[0012](2)一级种子培养：所述一级种子培养基组成如下：：葡萄糖8～10g/L，酵母膏5～10g/L，玉米浆5～10g/L,磷酸二氢钾2～5g/L，pH7.0
‑
8.0，121℃灭菌20min。无菌条件下接
种简单节杆菌斜面菌种，25～32℃、50～250rpm摇床振荡培养10～72h得到简单节杆菌一级种子液。
[0013](3)二级种子培养：所述二级种子培养基组成如下：葡萄糖8～10g/L，酵母膏5～10g/L，玉米浆5～10g/L，磷酸二氢钾2～5g/L，pH7.0
‑
8.0，121℃灭菌20min。无菌条件下接种简单节杆菌一级种子液，接种量2.5％～30％，25～32℃、50～250rpm摇床振荡培养10～72h，得到简单节杆菌二级种子液。
[0014](4)发酵罐培养：所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10～20g/L，酵母膏5～10g/L，玉米浆5～10g/L，磷酸二氢钾2～5g/L，pH7.0
‑
8.0。121℃灭菌20min。无菌条件下接入25～30％简单节杆菌二级种子液进入1L发酵罐，25℃～32℃、250～600rpm培养8～24h使得OD
600
在8～15之间。所得为发酵罐发酵液。
[0015]简单节杆菌的转化方法为
[0016](1)摇瓶转化：在生长好的二级种子液中加入底物与吐温
‑
80混合液、细胞壁干扰剂，放入摇床25～32℃、50～250rpm进行转化，每24h取样进行HPLC分析。
[0017](2)发酵罐转化：将发酵罐中的发酵液用磷酸将pH调节至7.0～8.0，同时在发酵罐中补料分批加入处理过的醋酸可的松、细胞壁干扰剂，转化条件为：25～32℃、400rpm，每6h取样进行HPLC分析。
[0018]具体的，所述青霉素G钠添加量为0.1～1g/L，DL
‑
正亮氨酸添加量为0.1～2g/L，杆菌肽添加量为0.01～0.1g/L，甘氨酸的添加量为20～50g/L。
[0019]优选的，底物醋酸可的松先与吐温
‑
80溶液混合、超声破碎0.5～1小时后，再加入发酵培养基中。
[0020]所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10～20g/L，酵母膏5～10g/L，玉米浆5～10g/L,磷酸二氢钾2～5g/L，pH值7.0～7.2。
[0021]优选的，发酵体系中发酵温度为25～32℃，转速为200～800rpm，通气量为0.2～0.4m3/h，罐压为0.02～0.1Mpa。
[0022]本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术采用细胞壁干扰剂提高了细胞壁的通透性，显著提高对甾醇的转化效率；本专利技术将底物与表面活性剂混合后破碎，增加了底物的分散性，从而提高甾体进出细胞膜的能力，进一步提高了转化率；本专利技术采用分批投料，有效的缓解了底物对菌体的毒害作用，有利于转化。
(四)附图说明
[0023]图1为实施例2～6的HPLC检测分析醋酸可的松转化率结果图。
[0024]图2为实施例7的HPLC检测分析醋酸可的松转化率结果图。
[0025]图3为实施例8的HPLC检测分析醋酸可的松转化率结果图。
(五)具体实施方式
[0026]下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：
[0027]实施例1：简单节杆菌的培养
[0028]本实施例采用的发酵培养基为：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，玉
米浆10g/L，pH值为7.0～7.2。
[0029]一级培养：对简单节杆菌(CPCC 140451)进行活化，随后转接入装有50mL上述种子培养基的250mL三角瓶中，于32℃、150r/min的条件下振荡培养15小时左右，得到一级培养液。
[0030]二级培养：将上述一级培养液按2％的接种量接入装有100mL上述种子培养基的500mL三角瓶中，于32℃、150rmin的条件下振荡培养15小时左右，得到二级培养液。
[0031]发酵罐培养：将上述二级培养液按15％的接种量接入装有1L上述发酵培养基的2L发酵罐中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种醋酸可的松的微生物发酵制备方法，所述方法包括：将含有3
‑
甾酮
‑1‑
脱氢酶的微生物接种至发酵培养基，加入底物醋酸可的松，并添加细胞壁干扰剂和表面活性剂，进行微生物发酵，发酵完成后，于发酵液中获得所述醋酸可的松；所述细胞壁干扰剂为下列之一：青霉素G钠，DL
‑
正亮氨酸，杆菌肽，甘氨酸。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述含有3
‑
甾酮
‑1‑
脱氢酶的微生物为简单节杆菌(Arthrobacter simp lex)CPCC 140451。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述表面活性剂为吐温
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，裘利峰，张博，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：