一种海绵烷骨架化合物的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种海绵烷骨架化合物的制备方法及其应用，所述方法为通过对来源于酸热脂环杆菌的角鲨烯环化酶进行改造，利用酶催化方法选择性合成了ent

【技术实现步骤摘要】
一种海绵烷骨架化合物的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及酶工程和天然产物的化学
‑
酶法合成领域，尤其涉及一种海绵烷骨架化合物的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]海绵烷类二萜化合物是从dictyoceratida海绵目和dendroceratida海绵目中分离出来的一类天然产物。该家族成员以6
‑6‑6‑
5四环体系为特征，或是其重排衍生物。海绵烷二萜具有广泛的生物活性，包括抗肿瘤、抗病毒、抗真菌和抗炎活性。(+)
‑
isoagatholactone是首个被分离鉴定的海绵烷二萜天然产物，可以抑制HeLa细胞的生长(IC
50
＝10μg/mL)。(+)
‑
Spongia
‑
16
‑
one是从澳大利亚海绵Dictyodendrilla cavernosa和新西兰海绵Chelonaplysilla violacea等生物体中分离出来的一种海绵烷二萜天然产物，它是各种ent
‑
isocopalane型海绵烷二萜化合物的重要前体，具有中等的抗肿瘤活性(对L1210和KB细胞系的IC
50
分别为5.0和9.2μg/mL)。
[0003]由于海绵烷类二萜化合物独特的分子结构和重要的生物活性，目前已经开发了几种化学方法以合成海绵烷类二萜化合物。这些合成策略多为化学半合成，例如，1981年，从天然产物迈诺醇出发，R
ú
veda课题组通过8步化学转化合成了(+)
‑
isoagatholactone(Imamura,P.M,et.al)；1983年，Nakano课题组以消旋的黄脂酸为起始化合物，以8.1％的总产率、通过5步化学转化合成了消旋产物(
±
)
‑
isoagatholactone(Nakano,T.,et.al)；1984年，Ungur课题组通过酸催化的二环乙酸酯的环化反应、以3步转化合成了(+)
‑
isoagatholactone(Vlad,P.F.,et.al)；1996年，Zaragoza课题组从松香酸出发，以20步化学转化完成了(+)
‑
isoagatholactone的合成(Abad,A.,et.al)；2016年，Zeng课题组通过8步化学转化完成了(+)
‑
isoagatholactone对映异构体的合成(Ren,J.,et.al)；1996年，Roberts课题组以自由基串联环化反应为关键步骤、通过15步化学转化完成了消旋产物(
±
)spongia
‑
16
‑
one的全合成(Pattenden,G.,et.al)；2001年，Demuth课题组发展了一条以光催化的自由基串联环化反应为关键步骤的(
±
)spongia
‑
16
‑
one的仿生合成策略，其总产率为11％(Goeller,F.,et.al)。这些策略的主要缺点是合成路线长、立体选择性适中、氧化还原经济性较差。基于此，海绵烷二萜的构效关系研究非常有限。
[0004]除海绵烷二萜化合物外，自然界还存在一类包含ent
‑
isocopalane型萜类结构和α
‑
吡喃酮结构的杂萜天然产物。这类天然产物普遍具有生物活性，包括抗胆碱酯酶活性、抑制乙酰辅酶A/胆固醇酰基转移酶的活性、抗分枝杆菌、杀虫和细胞毒性等。这些杂萜天然产物的化学合成策略主要有三种：第一种为仿生合成策略，首先立体选择性构建含有环氧结构的多烯底物，然后利用路易斯酸催化的多烯串联环化反应构建C3
‑
OH萜类骨架；第二种合成策略是利用Wieland
‑
Miescher酮等衍生化后通过C
‑
C键形成反应进行模块化组装，由于这种方法需要在十氢萘环骨架上进行多步化学转化，因此合成效率较低；第三种合成策略是手性元策略，香紫苏内酯和香紫苏醇由于具有与真菌杂萜类天然产物相同的反式十氢萘环结构和手性中心，是合成这类天然产物合适的起始原料，但是需要对C3位进行羟基化。已
知的化学方法对香紫苏内酯的碳
‑
氢键官能团化以C2位官能团化产物为主；而利用生物转化的方法虽然可以实现香紫苏内酯的C3位羟基化，但仍存在区域选择性差、过度氧化等问题。
[0005]2020年，Renata课题组以香紫苏醇为底物，利用生物催化的C
‑
H键氧化和基于自由基的交叉偶联反应相结合的策略，通过11步转化首次完成了chavone A的合成。
[0006][0007]海绵烷二萜天然产物与α
‑
吡喃酮杂萜化合物的化学合成策略具有一定的相似之处：(1)两类化合物都可以采取手性元策略，从其他具有相似骨架的萜类化合物出发，通过官能团的转换、碳碳键的形成以及环化反应，实现复杂环系的构建和新的手性中心的引入；(2)两类化合物也可以采用仿生合成策略，由多烯底物经由碳正离子或自由基串联环化反应实现多环体系的构建，产物手性中心的立体化学由底物的手性中心和反应过渡态的构象决定；(3)两类化合物也可以通过逆合成分析切断为结构更为简单的二环单元，通过碳碳键形成反应进行汇聚式连接。
[0008]但是，这些合成策略具有一些缺点：(1)手性元策略中所采用的其他萜类化合物往往需要经过多步官能团转换才能得到关键反应前体，使合成路线变得冗长；(2)利用多烯串联环化的仿生合成策略需要引入手性环氧等官能团，并在环化后还原所产生的羟基，增加了不必要的合成步骤，违背了步骤经济性和氧化还原经济性原则；(3)碳正离子或自由基介导的多烯串联环化反应虽然能够获得目标化合物，但是非对映选择性往往不够理想；(4)无论何种策略都难以避免苛刻的反应条件、较低的产率和选择性等化学合成中常见的问题。此外，通过天然来源提取的方式分离纯化海绵烷二萜天然产物与α
‑
吡喃酮杂萜化合物步骤繁琐、总收率低、提取成本高且极易造成环境的破环，难以可持续。这些因素限制了海绵烷二萜天然产物与α
‑
吡喃酮杂萜化合物的结构类似物的合成与生物活性的研究。
[0009]因此，现有技术还有待改进，发展更为高效、高选择性的发散性合成策略具有重要意义。

技术实现思路

[0010]鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种海绵烷骨架化合物的制备方法及其应用，通过提供一类海绵烷骨架化合物的酶催化合成方法，以及萜类天然产物的化学
‑
酶法合成方法，旨在解决目前难以高效、高选择性合成海绵烷二萜天然产物与α
‑
吡喃酮杂萜化合物的问题。
[0011]本专利技术采用的技术方案如下：
[0012]一种海绵烷骨架化合物的制备方法，其中，所述海绵烷骨架化合物由野生型角鲨
烯环化酶或其突变体催化底物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种海绵烷骨架化合物的制备方法，其特征在于，所述海绵烷骨架化合物由野生型角鲨烯环化酶或其突变体催化底物香叶基香叶醇生成；所述突变体发生突变的氨基酸位点为角鲨烯环化酶第261位的异亮氨酸，所述异亮氨酸突变为甘氨酸、苏氨酸或天门冬酰胺中的其中一种。2.根据权利要求1所述的海绵烷骨架化合物的制备方法，其特征在于，所述海绵烷骨架化合物为ent
‑
isocopalane型骨架化合物，所述ent
‑
isocopalane型骨架化合物结构式如1或2所示：3.根据权利要求1所述的海绵烷骨架化合物的制备方法，其特征在于，所述野生型角鲨烯环化酶的核苷酸序列如SEQ.ID NO 1所示，氨基酸序列如SEQ.ID NO 2所示。4.根据权利要求1所述的海绵烷骨架化合物的制备方法，其特征在于，所述海绵烷骨架化合物的制备方法包括步骤：构建AacSHC模板质粒；对所述AacSHC模板质粒进行定点突变，构建AacSHC突变体重组质粒；将所述AacSHC模板质粒以及AacSHC突变体重组质粒分别转入大肠杆菌中，表达并纯化AacSHC蛋白，分别得到野生型AacSHC蛋白以及突变体AacSHC蛋白；通过体外酶催化实验筛选所述突变体AacSHC蛋白，筛选得到突变体AacSHC
‑
I261G/T/N；利用野生型AacSHC蛋白或者突变体AacSHC
‑
I261G/T/N催化底物香叶基香叶醇，进行海绵烷骨架化合物的体外酶催化合成，获得所述海绵烷骨架化合物。5.根据权利要求4所述的海绵烷骨架化合物的制备方法，其特征在于，将来源于酸热脂环杆菌的角鲨烯环化酶基因AacSHC克隆至质粒pET28a上，构建得到所述AacSHC模板质粒；对所述AacSHC模板质粒进行定点突变，选择角鲨烯环化酶活性中心的氨基酸残基I261进行突变，构建AacSHC突变体重组质粒。6.根据权利要求4所述的海绵烷骨架化合物的制备方法，其特征在于，通过体外酶催化实验筛选所述AacSHC蛋白的具体步骤为：将野生型AacSHC蛋白或突变体AacSHC蛋白加入到含有香叶基香叶醇的反应缓冲液中，置于50℃，120 rpm摇床中进行酶催化反应；通过GC
‑
MS分析AacSHC蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：项征，王素静，肖雯，于明珠，沙凤，
申请(专利权)人：北京大学深圳研究生院，
类型：发明
国别省市：