一种催化生产熊去氧胆酸的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种催化生产熊去氧胆酸的方法及应用，属于基因工程与生物催化领域。本发明专利技术提供了基于辅因子循环再生的酶共表达“两步法”催化生产熊去氧胆酸和基于辅因子循环再生系统单独表达酶催化高效生产熊去氧胆酸，并通过优化反应条件，显著提高了催化反应的转化率，使催化鹅去氧胆酸生成熊去氧胆酸的转化率均达90％以上。采用本发明专利技术的方法可提高生产效率，在医药化学品等等领域中有巨大的应用前景。景。景。

【技术实现步骤摘要】
一种催化生产熊去氧胆酸的方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种催化生产熊去氧胆酸的方法及应用，属于基因工程与生物催化领域。

技术介绍

[0002]熊去氧胆酸(Ursodesoxycholic acid，UDCA)，化学名称为3α，7β
‑
二羟基
‑
5β
‑
胆甾烷
‑
24
‑
酸，是美国FDA批准的唯一一种用于治疗原发性胆汁性肝硬化(PBC)的一线药物，是一种具有多种生物活性的亲水性胆汁酸，也是治疗胆汁淤积性肝病的重要药物。在近些年的研究发现，UDCA在治疗癌症方面有着显著的疗效，UDCA可特异性的调控细胞凋亡的阈值，抑制癌细胞的生长并诱导细胞自噬和凋亡。
[0003]7β
‑
羟基类固醇脱氢酶(7β
‑
hydroxysteroid dehydrogenas，7β
‑
HSDH，EC 1.1.1.201)，是一类NADP(H)依赖性酶，属于短链脱氢酶/还原酶(SDR)超家族，反向催化类固醇、胆汁酸和其他类固醇衍生物的羟基的氧化反应，一般具有较高的立体选择性和区域选择，是制备熊去氧胆酸的关键生物催化剂，可以将C
‑
7位上的酮羰还原成位β取向的羟基。7β
‑
HSDH来源广泛，可以从NCBI数据库中检索出多种不同来源的7β
‑
HSDH，目前，已报道微生物来源的有：Clostridium absonum、Collinsella aerofaciens、Ruminococcus gnavus、Ruminococcus Torques、Xanthomonas maltophilia和Lactobacillus spicheri它们之中有由野生型微生物进行表达，也有将其基因克隆到其他宿主细胞中进行表达。
[0004]近年来，生物催化制备UDCA的技术发展迅速，相较于化学合成具有绿色高效且安全等优势。辅因子再生系统是氧化还原酶类的催化反应体系的提供氢离子的核心技术。鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)可以通过两步的转化为UDCA，首先，将C
‑
7的α取向的羟基氧化为羰基生成中间产物7
‑
酮基
‑
石胆酸(7
‑
Ketolithocholic acid，7K
‑
LCA)这其中伴随着NAD(P)
+
转化为NAD(P)H，紧接着将7K
‑
LCA的C
‑
7的羰基还原为β取向的羟基生成最我们所需的UDCA，同时伴随着NAD(P)H转化为NAD(P)
+
。通过这种转化模式，我们提出了两种制备UDCA的生产工艺：一锅法，即通过7β
‑
HSDH与另一种依赖相同辅因子的7α
‑
HSDH通过这两种酶自身氧化还原循环利用辅因子以达到制备UDCA的目的。两步法，即先通过7α
‑
HSDH将CDCA氧化为7K
‑
LCA，这期间通过丙酮酸脱氢酶(LDH)消耗丙酮酸来不断再生NAD(P)
+
提供给7α
‑
HSDH氧化CDCA，紧接着通过简单的热灭火终止反应后，添加7β
‑
HSDH将7K
‑
LCA还原为UDCA，这期间通过葡萄糖脱氢酶(GDH)消耗葡萄糖来再生NAD(P)H提供给7β
‑
HSDH还原7K
‑
LCA。
[0005]通过酶催化方法实现熊去氧胆酸的高效生产需要具有高催化活性和高转换率的7β
‑
HSDH，同时需要可高效转化效率底物生成熊去氧胆酸的催化工艺。单一酶的表达后混合应用，使得整个工艺过程比较复杂，不利于熊去氧胆酸的工业化生产。高催化活性和高转换率的7β
‑
HSDH的筛选及催化工艺的优化对于熊去氧胆酸的工业化生产具有重要意义。因此，如何得到一种能够高效生产熊去氧胆酸的方法成为研究的热点和难点。

技术实现思路

[0006]为解决7β
‑
HSDH低催化活性和低转化率及催化工艺不成熟等问题，本专利技术提供了基于辅因子循环再生系统的熊去氧胆酸生产方法，包括(a)或(b)：
[0007](a)基于辅因子循环再生的酶共表达“两步法”催化生产熊去氧胆酸；
[0008](b)基于辅因子循环再生系统单独表达酶催化生产熊去氧胆酸。
[0009]在一种实施方式中，所述共表达包括(1)或(2)：
[0010](1)共表达7α
‑
羟基类固醇脱氢酶7α
‑
HSDH和异丙酮脱氢酶ADH，共表达7β
‑
HSDH与葡萄糖脱氢酶GDH，和/或共表达7α
‑
羟基类固醇脱氢酶7α
‑
HSDH与乳酸脱氢酶LDH的细胞组合；
[0011](2)共表达7α
‑
HSDH_Cd和7β
‑
HSDH_Osp的细胞。
[0012]在一种实施方式中，所述共表达是采用质粒共表达7α
‑
羟基类固醇脱氢酶7α
‑
HSDH_Cd和异丙酮脱氢酶ADH；采用质粒共表达7β
‑
HSDH_Osp与葡萄糖脱氢酶GDH；采用质粒共表达7α
‑
羟基类固醇脱氢酶7α
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HSDH_Es与乳酸脱氢酶LDH。
[0013]在一种实施方式中，所述7β
‑
HSDH来源于微生物Olsenella sp.、Clostridium absonum、Collinsella aerofaciens、Ruminococcus gnavus、Ruminococcus Torques、Xanthomonas maltophilia或Lactobacillus spicheri等；优选于来源于Olsenella sp.的7β
‑
HSDH_Osp；其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0014]在一种实施方式中，所述7α
‑
HSDH来源于微生物Clostridioides difficile、Xanthomonas maltophilia、Escherichia coli、Clostridium absonum、Clostridium difficile、Clostridium sordellii或Bacteroides fragilis；其中优选于来源于Clostridioides difficile的7α
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HSDH_Cd，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0015]在一种实施方式中，所述异丙酮脱氢酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于辅因子循环再生系统的熊去氧胆酸生产方法，其特征在于，包括(a)或(b)：(a)基于辅因子循环再生的酶共表达“两步法”催化生产熊去氧胆酸；(b)基于辅因子循环再生系统单独表达酶催化生产熊去氧胆酸；所述共表达包括(1)或(2)：(1)共表达7α
‑
羟基类固醇脱氢酶7α
‑
HSDH和异丙酮脱氢酶ADH，共表达7β
‑
羟基类固醇脱氢酶7β
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HSDH和葡萄糖脱氢酶GDH，和/或共表达7α
‑
羟基类固醇脱氢酶7α
‑
HSDH与乳酸脱氢酶LDH的细胞组合；(2)共表达7α
‑
HSDH_Cd和7β
‑
HSDH_Osp的细胞；所述单独表达酶是分别表达7α
‑
羟基类固醇脱氢酶、异丙酮脱氢酶ADH，7β
‑
羟基类固醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶GDH、乳酸脱氢酶，再将酶液共同用于催化生产熊去氧胆酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述7β
‑
羟基类固醇脱氢酶来源于微生物Olsenella sp.、Clostridium absonum、Collinsella aerofaciens、Ruminococcus gnavus、Ruminococcus Torques、Xanthomonas maltophilia或Lactobacillus spicheri；所述7α
‑
羟基类固醇脱氢酶来源于微生物Clostridioides difficile、Xanthomonas maltophilia、Escherichia coli、Clostridium absonum、Clostridium difficile、Clostridium sordellii或Bacteroides fragili；所述异丙酮脱氢酶来源于Caldanaerobacter subterraneus；所述葡萄糖脱氢酶来源于微生物Bacillus vallismortis；所述乳酸脱氢酶来源于Lactobacillus delbrueckii。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，用于共表达基因的质粒包括但不限于pET22a、pET22b、pET28a、pRSFDuet
‑
1或pETDuet
‑
1。4.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，以pRSFDuet
‑
1或pETDuet
‑
1共表达7α
‑
羟基类固醇脱氢酶和异丙酮脱氢酶ADH，或共表达7β
‑
羟基类固醇脱氢酶7β
‑
HSDH和葡萄糖脱氢酶GDH，或共表达7α
‑
羟基类固醇脱氢酶7α
‑
HSDH与乳酸脱氢酶LDH。5.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。6.根据权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，基于辅因子循环再生系统单独表达酶进行的催化反应具体为：第一步反应：在10
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100mM的磷酸钾缓冲液(pH＝7.0
‑
9.0)、1
‑
100mM鹅去氧胆酸、10
‑
60mM丙酮酸钠或2
‑
50％丙酮、1
...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨海泉，陈献忠，刘万隆，沈微，夏媛媛，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：