【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于噬菌体保藏，具体涉及一种高效弧菌噬菌体的液体保藏方法。
技术介绍
1、噬菌体是一类感染细菌、真菌的病毒的总称，其能够特异识别并裂解宿主病原菌，当前关于应用噬菌体疗法控制细菌性疾病的研究已然成为一种新的热点与趋势，并逐渐得到权威机构的认可。然而噬菌体在应用过程中，如何最大限度的保持噬菌体效价水平（噬菌体本身活性），是其应用过程关键一环，决定了噬菌体能否大规模应用的范围，是噬菌体产品推广的关键。
2、噬菌体在保藏过程中，诸多因素会影响其效价：①保藏温度(室温、冷藏、冷冻、液氮等)；②温度变化(运输过程、保藏期间、立即使用之前等)；③非胶体物质(非离子型的，如糖、甘油等)；④胶体物质(蛋白质辅料，如脱脂牛奶等)；⑤介质中游离的离子(如mg2+等)；⑥含水量；⑦可见光(包括制备过程)；⑧保藏密度(过高可能导致聚集；过低造成效价损失或浪费储存容器)；⑨污染物(病原菌、洗涤剂、辅料或滤出杂质)；⑩制备过程(如冷却速率、干燥温度和升温温度)；⑪冷冻问题(不均匀性、产生冰晶体、冷冻保护剂和解冻速率)。
3、目前，常用的噬菌体保藏方法主要分为悬液法、冷冻干燥法。每种噬菌体的性质各不相同，若保藏方法不当会造成极大损失。常规的悬浮液法缺点是易受污染，不适于大批量运输。氯仿chcl3具有除菌抑菌的效果，能溶解细菌中的脂质成分，而噬菌体缺乏脂质成分，添加氯仿后一般保藏在4℃，然而单纯的使用氯仿保藏噬菌体之前应当确定噬菌体是否对氯仿具有耐受性，氯仿的添加与否取决于噬菌体的种类及需求度，若有特殊需要可适当添加以稳定活性。
4、目前噬菌体作为新型抑菌策略在水产养殖领域的认可度越来越高，基于成本和应用方式考虑，液体状态噬菌体制剂使用性价比较高，然而在储存方式方面液体制剂容易染菌，造成使用过程二次污染。
5、中国专利cn112538463a公开了一种新型嗜水气单胞菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用，说明书中提及弧菌噬菌体与苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙等组合保藏，但是考虑到该专利只是粗略说明其组成成分包含以上组分，并未对组分含量及有效保藏时间做出验证分析与明确，且其涉及目标为嗜水气单胞菌噬菌体，本申请详细验证了18个月内4度与常温状态下，目标弧菌噬菌体的保存状态及效价损失情况，对实际保藏与应用具有极强指导意义，基于噬菌体形态差异及实际应用涉及具体问题等方面，现有技术显得略有不足。
技术实现思路
1、针对现有技术中易受污染，不适于大批量运输、不能常温保存运输，不利于噬菌体规模化应用等不足，本专利技术提供一种高效弧菌噬菌体的液体保藏方法，适应当下噬菌体在水产养殖领域的应用要求，提高噬菌体液体保藏效果，降低噬菌体大规模应用的生产成本。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案来实现：
3、一种高效弧菌噬菌体的液体保藏方法，包括以下步骤：
4、第一步：纯化弧菌噬菌体、富集，规模化发酵培养至弧菌噬菌体效价水平≥109pfu/ml，获得梯度富集的弧菌噬菌体悬浮液；
5、第二步：弧菌噬菌体悬浮液微滤，保留过滤液分装收集于蓝口瓶中备用；
6、第三步：确定其对氯仿是否敏感；
7、第四步：向弧菌噬菌体悬浮液中加入液体保藏添加剂；
8、第五步：收集处理好的弧菌噬菌体悬浮液，分装弧菌噬菌体悬浮液制剂于密闭容器中。
9、进一步地，所述第一步具体步骤为：
10、s1、纯化弧菌噬菌体：用无菌200 μl枪头在双层琼脂平板中挑取形态大小均一的噬菌斑，将其分别加入到1 ml无菌pbs的离心管中，涡旋震荡1 min，4℃下静置4 h，使弧菌噬菌体充分释放入pbs中；4℃、10000rpm离心5 min，收集上清，过0.22 μm膜，将弧菌噬菌体滤液进行十倍梯度稀释，双层培养，重复3次上述操作，直至出现的噬菌斑形态、大小完全一致为止，即得到纯化弧菌噬菌体；
11、s2、富集：采用摇瓶发酵和20l小型发酵罐进行弧菌噬菌体悬浮液的梯度富集。
12、进一步地，所述采用摇瓶发酵和20l小型发酵罐进行噬菌体悬浮液的梯度富集具体步骤为：
13、s21、将纯化弧菌噬菌体摇瓶发酵获得弧菌噬菌体种子液，按照moi值为0.1进行感染，加入4℃贮存弧菌噬菌体种子液，进行初次摇瓶发酵富集，微滤处理收集发酵液；
14、s22、酒精火环法灭菌20l小型发酵罐接种口，接种宿主菌液，加入s21获取的噬菌体发酵液，每隔1h观察20l小型发酵罐内培养基状态，待出现碎片时进行记录压力、水温、ph值、溶解氧的变化，直至噬菌体效价水平≥109pfu/ml即出现大量的细菌碎片，停止发酵，获得梯度富集的弧菌噬菌体悬浮液。
15、进一步地，所述第二步弧菌噬菌体悬浮液微滤步骤为，获得的梯度富集的弧菌噬菌体悬浮液采用陶瓷膜初次过滤，并继续使用微滤柱过滤，滤液分装收集于蓝口瓶中备用，4℃储存。
16、进一步地，所述第二步具体步骤为：将培养液通过500nm陶瓷膜进行初级过滤，随后经0.22 μm孔径玻璃纤维微滤柱微滤，离心泵出口压力控制在1.0 mpa-2.0mpa，保留过滤液分装收集于蓝口瓶中备用，迅速保存至4℃冰箱。
17、进一步地，所述第三步具体步骤为：取10ml蓝口瓶中放置的噬菌体过滤液置于50ml离心管中，按v/v比例1:100加入氯仿，混匀震荡30 s后静置分层，3000 rpm离心5 min后取上层液体十倍梯度稀释，用单层平板法测定噬菌体效价，对比加入氯仿前后噬菌体效价变化情况。
18、进一步地，所述第四步液体保藏添加剂为氯仿、山梨酸钾、苯甲酸钠和明胶；所述经微滤过后的噬菌体液体悬浮液、氯仿、山梨酸钾、苯甲酸钠和明胶按质量份数配比如下：经微滤过后的噬菌体液体悬浮液100份、氯仿0.1-0.6份、山梨酸钾0.05-0.25份、苯甲酸钠0.2-0.8份和明胶0.5-1份。
19、本申请弧菌噬菌体为灿烂弧菌噬菌体pvs-2和副溶血弧菌噬菌体pvp1，灿烂弧菌噬菌体pvs-2保藏编号为cgmcc no.12263，保藏日期为2016年05月06日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ccmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；副溶血弧菌噬菌体pvp1，保藏编号为cgmcc no.17991，保藏日期为2019年6月13日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ccmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
20、有益效果
21、1、在传统噬菌体悬浮保藏基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高效弧菌噬菌体的液体保藏方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的高效弧菌噬菌体的液体保藏方法，其特征在于，所述第一步具体步骤为：
3.根据权利要求2所述的高效弧菌噬菌体的液体保藏方法，其特征在于，所述采用摇瓶发酵和20L小型发酵罐进行噬菌体悬浮液的梯度富集具体步骤为：
4.根据权利要求1所述的高效弧菌噬菌体的液体保藏方法，其特征在于：所述第二步弧菌噬菌体悬浮液微滤步骤为，获得的梯度富集的弧菌噬菌体悬浮液采用陶瓷膜初次过滤，并继续使用微滤柱过滤，滤液分装收集于蓝口瓶中备用，4℃储存。
5.根据权利要求4所述的高效弧菌噬菌体的液体保藏方法，其特征在于，所述第二步具体步骤为：将培养液通过500nm陶瓷膜进行初级过滤，随后经0.22 μm孔径玻璃纤维微滤柱微滤，离心泵出口压力控制在1.0 MPa-2.0MPa，保留过滤液分装收集于蓝口瓶中备用，迅速保存至4℃冰箱。
6.根据权利要求1所述的高效弧菌噬菌体的液体保藏方法，其特征在于，所述第三步具体步骤为：取10mL蓝口瓶中放置的噬菌体过滤液置于50 mL离
7.根据权利要求1所述的高效弧菌噬菌体的液体保藏方法，其特征在于：所述第四步液体保藏添加剂为氯仿、山梨酸钾、苯甲酸钠和明胶；所述经微滤过后的噬菌体液体悬浮液、氯仿、山梨酸钾、苯甲酸钠和明胶按质量份数配比如下：经微滤过后的噬菌体液体悬浮液100份、氯仿0.1-0.6份、山梨酸钾0.05-0.25份、苯甲酸钠0.2-0.8份和明胶0.5-1份。
...【技术特征摘要】
1.一种高效弧菌噬菌体的液体保藏方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的高效弧菌噬菌体的液体保藏方法，其特征在于，所述第一步具体步骤为：
3.根据权利要求2所述的高效弧菌噬菌体的液体保藏方法，其特征在于，所述采用摇瓶发酵和20l小型发酵罐进行噬菌体悬浮液的梯度富集具体步骤为：
4.根据权利要求1所述的高效弧菌噬菌体的液体保藏方法，其特征在于：所述第二步弧菌噬菌体悬浮液微滤步骤为，获得的梯度富集的弧菌噬菌体悬浮液采用陶瓷膜初次过滤，并继续使用微滤柱过滤，滤液分装收集于蓝口瓶中备用，4℃储存。
5.根据权利要求4所述的高效弧菌噬菌体的液体保藏方法，其特征在于，所述第二步具体步骤为：将培养液通过500nm陶瓷膜进行初级过滤，随后经0.22 μm孔径玻璃纤维微滤柱微滤，离心泵出口压力控制在1.0 mpa...
【专利技术属性】
技术研发人员：李振，任宏宇，齐志涛，魏畅，王振辉，
申请(专利权)人：盐城工学院，
类型：发明
国别省市：
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