【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种基于线粒体功能障碍的干眼细胞模型的构建方法。
技术介绍
1、干眼作为最常见的眼表疾病之一，不仅可引起眼部不适感，而且重症干眼可致盲，严重影响患者的生活质量。随着电子设备的广泛使用以及人们生活方式、工作强度和居住环境等的改变，干眼在世界人口中的患病率为5-50％。因干眼受多种因素的影响，目前仍缺乏有效的治疗方法。干眼的发病机制复杂，其中线粒体功能障碍在干眼发生发展中的作用越来越受到研究者们的关注。现有的干眼细胞模型常为利用高渗处理人角膜上皮细胞。例如，有文章报道采用不同浓度的苯扎氯铵分别作用于体外培养的角膜上皮细胞，光镜观察细胞形态学的改变，检测细胞活性和细胞凋亡，制得干眼角膜上皮细胞损伤模型。这种基于高渗处理人角膜上皮细胞所构建的模型性状并不稳定，不同批次、不同浓度和处理时间所得到的干眼细胞模型的性状不同，甚至同一处理批次所得到的干眼细胞模型的性状也是不同的。这也限制了基于干眼细胞模型所做的有关治疗方案的研究结论之间的横向比较。高浓度也容易导致大量的细胞凋亡，模型构建成功率过低，浪费时间、试剂材料和人力成本，而低浓度可能无法导致细胞出现显著的线粒体功能障碍。
2、此外，尽管在高渗诱导的干眼细胞模型中也可能会观察到细胞线粒体功能的改变，但高渗处理对角膜上皮细胞的影响是多方面的、复杂和综合的，容易产生很多不需要甚至对后续研究产生干扰的细胞性状特点，并不能真实反映由角膜上皮细胞线粒体功能障碍导致干眼发生的病理改变以及用于评价相关方案的治疗效果。因此，目前缺少一种可高效和精准构建线粒体功能障碍
技术实现思路
1、(一)要解决的技术问题
2、鉴于现有技术的上述缺点、不足，本专利技术提供一种基于线粒体功能障碍的干眼细胞模型的构建方法，其采用靶向敲除/敲低人角膜上皮细胞tfam的表达来建立一种能更好、更真实的反映线粒体功能障碍诱发的干眼细胞模型。本专利技术的方法具有模型构建成功率高、模型性状/特征更稳定，不产生非目标细胞性状，细胞模型具有显著的线粒体功能障碍的特点，有利于开展下游的线粒体功能障碍在干眼发生发展中的机制研究或治疗方案之间的横向比较。
3、(二)技术方案
4、本专利技术的技术方案如下：
5、一种基于线粒体功能障碍的干眼细胞模型的构建方法，其采用靶向敲除或敲低人角膜上皮细胞tfam表达水平的方法对体外培养的人角膜上皮细胞进行处理，进而定向构建得到线粒体功能障碍诱发的干眼细胞模型。
6、据本专利技术的较佳实施例，靶向敲除或敲低人角膜上皮细胞tfam表达水平的方法，包括使用靶向敲除或敲低细胞中tfam基因的sirna、vector-based shrna、crispr/cas9编辑系统、转录激活样效应核酸酶技术talen、锌指核酸酶技术zinc finger nuclease中的至少一种对体外培养的人角膜上皮细胞进行处理。
7、据本专利技术的较佳实施例，靶向敲除或敲低细胞中tfam基因的sirna是由如下四种sirna按照1:1:1:1的摩尔比等量组合得到：
8、sirna-1的核酸序列为：cggaguggcagguauauaa；
9、sirna-2的核酸序列为：ccaagaagcuaagggugau；
10、sirna-3的核酸序列为：gaaaucauggacaaacauu；
11、sirna-4的核酸序列为：gaagaauugcccagcguug。
12、根据本专利技术的较佳实施例，所述构建方法包括：采用靶向敲除或敲低细胞中tfam基因的sirna分散在sirna buffer中，再添加buffer和reagent得到转染混合液，使用转染混合液处理体外培养的人角膜上皮细胞。
13、根据本专利技术的较佳实施例，在所述处理液中，sirna的总浓度为25-50nmol/l，优选为25nmol/l。
14、根据本专利技术的较佳实施例，包括如下步骤：
15、(1)使用0.25％胰酶在37℃下消化人角膜上皮细胞并计数；用含抗生素的完全培养基重悬细胞，在24孔板的每孔中加入450μl细胞悬液，使每孔细胞数为1×105；37℃，5％co2条件，过夜孵育细胞；
16、(2)使用浓度为25-50nmol/l sirna的转染混合液，在37℃，5％ co2中培养人角膜上皮细胞24-48h。
17、根据本专利技术的较佳实施例，转染结束后，还包括如下操作：利用western blot和免疫荧光检测细胞中tfam蛋白水平的表达情况、利用cck8检测细胞活性、利用tmrm检测线粒体膜电位、定量pcr检测mtdna拷贝数、seahorse能量代谢方法分析线粒体功能、实时定量rt-pcr和免疫荧光检测炎性因子的表达水平。
18、(三)有益效果
19、本专利技术通过敲低人角膜上皮细胞中tfam的表达，可准确/高效且定向地构建出具有明显线粒体功能损伤特征的干眼细胞模型，与现有干眼细胞模型的构建方法相比，本专利技术的方法简便、快速、且构建的细胞模型性状或特性稳定，不易产生多方面的、复杂的不需要的、甚至可能对后续研究产生干扰的细胞性状特点，本专利技术更适于线粒体功能障碍在干眼发生发展中的机制研究。
20、本专利技术的细胞模型构建方法，可最大限度地保留非线粒体功能障碍所导致的细胞生理学特性，细胞模型构建成功率高，省时省力。本专利技术的应用包括：构建一种能更真实的反映线粒体功能障碍诱发的干眼细胞模型，以便于开展针对线粒体功能障碍诱发的干眼细胞模型的理论研究和新型药物/治疗方案的研发。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种基于线粒体功能障碍的干眼细胞模型的构建方法，其特征在于，其采用靶向敲除或敲低人角膜上皮细胞TFAM表达水平的方法对体外培养的人角膜上皮细胞进行处理，进而定向构建得到线粒体功能障碍诱发的干眼细胞模型。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，靶向敲除或敲低人角膜上皮细胞TFAM表达水平的方法，包括使用靶向敲除或敲低细胞中TFAM基因的siRNA、Vector-basedshRNA、CRISPR/Cas9编辑系统、转录激活样效应核酸酶技术TALEN、锌指核酸酶技术Zincfinger nuclease中的至少一种对体外培养的人角膜上皮细胞进行处理。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，靶向敲除或敲低细胞中TFAM基因的siRNA是由如下四种siRNA按照1:1:1:1的摩尔比等量组合得到：
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：采用靶向敲除或敲低细胞中TFAM基因的siRNA分散在siRNA Buffer中，再添加buffer和reagent得到转染混合液，使用转染混合液处理体外培养的人角膜上皮细胞
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，在所述处理液中，siRNA的总浓度为25-50nmol/L，优选为25nmol/L。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，转染结束后，还包括如下操作：利用Western blot和免疫荧光检测细胞中TFAM蛋白水平的表达情况、利用CCK8检测细胞活性、利用TMRM检测线粒体膜电位、定量PCR检测mtDNA拷贝数、Seahorse能量代谢方法分析线粒体功能、实时定量RT-PCR和免疫荧光检测炎性因子的表达水平。
...【技术特征摘要】
1.一种基于线粒体功能障碍的干眼细胞模型的构建方法，其特征在于，其采用靶向敲除或敲低人角膜上皮细胞tfam表达水平的方法对体外培养的人角膜上皮细胞进行处理，进而定向构建得到线粒体功能障碍诱发的干眼细胞模型。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，靶向敲除或敲低人角膜上皮细胞tfam表达水平的方法，包括使用靶向敲除或敲低细胞中tfam基因的sirna、vector-basedshrna、crispr/cas9编辑系统、转录激活样效应核酸酶技术talen、锌指核酸酶技术zincfinger nuclease中的至少一种对体外培养的人角膜上皮细胞进行处理。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，靶向敲除或敲低细胞中tfam基因的sirna是由如下四种sirna按照1:1:1:1的摩尔比等量组合得到：
4.根据权利要求3所述的构...
【专利技术属性】
技术研发人员：接英，李亚琼，田磊，李思源，保佳玉，雷峰阳，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京同仁医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。