【技术实现步骤摘要】
本申请涉及基因工程，特别涉及一种具有天然活性的重组贻贝黏蛋白及其制备方法与应用。
技术介绍
1、贻贝是双壳类软体动物，俗称海虹和青口，可在水环境中牢固地黏附于各种不同材料表面，其足丝中起黏附作用的物质已被证明是各种贻贝足黏蛋白。贻贝足黏蛋白(mytilus edulis foot protein, mefp)是由贻贝类腹足附近的足腺合成并泌到足丝的一类特殊的黏性蛋白质，是足丝的主要成分，又称多酚蛋白质或贻贝黏附蛋白质。mefp 黏合强度高，能在水下迅速凝固成有黏附能力的附着基，呈生物惰性并具有生物降解的特性，生物相容性好，对人体无毒、无害、无免疫原性，具有合成胶水所不具有的特殊优势，可作为生物黏合剂广泛用于软组织黏接、人造骨骼断骨接合、口腔修复以及眼科手术等，有可能成为今后医用黏合剂研究的主流。
2、现有贻贝黏蛋白产品主要是从贻贝足丝腺体中提取获得的天然黏附蛋白，但由于贻贝黏附蛋白的分泌量很低，提取1g黏附蛋白大约需要30000只贻贝；或采用基因工程法制备重组贻贝黏蛋白，但该方法存在产率较低、纯化量低且纯化工艺复杂等缺陷，进而造成制备贻贝黏蛋白纯品的效率及产量均较低，极大的限制了贻贝黏蛋白的应用。
技术实现思路
1、本申请的主要目的是提供一种具有天然活性的重组贻贝黏蛋白及其制备方法与应用，旨在解决现有方法对贻贝黏蛋白的制备效率及产量均较低的技术问题。
2、为实现上述目的，本申请第一种实施例提出了：一种具有天然活性的重组贻贝黏蛋白，将如seq id no.3氨
3、所述酪氨酸羟化酶的氨基酸序列如seq id no.5所示。
4、作为本申请一些可选实施方式，编码所述酪氨酸羟化酶的核苷酸序列如seq idno.6所示。
5、作为本申请一些可选实施方式，所述重组贻贝黏蛋白是贻贝黏蛋白mefp-3a和纤连蛋白主要结构域fn10序列串联获得的。
6、作为本申请一些可选实施方式，所述贻贝黏蛋白mefp-3a的氨基酸序列如seq idno.1所示，所述纤连蛋白主要结构域fn10的氨基酸序列如seq id no.2所示。
7、作为本申请一些可选实施方式，编码所述重组贻贝黏蛋白的核苷酸序列如seq idno.4所示。
8、为实现上述目的，本申请第二种实施例还提出了：一种如上所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，包括以下步骤：
9、获取目标核苷酸序列，构建质粒；
10、制备感受态细胞，并将所述质粒电转化至所述感受态细胞，进行经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌；
11、将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液；将所述诱导上清液纯化后，获得目标重组贻贝黏蛋白。
12、作为本申请一些可选实施方式，所述获取目标核苷酸序列，构建质粒的步骤，包括：
13、基于如seq id no.4所示的核苷酸序列，构建ppic9k-fn10-mfp3质粒；
14、基于如seq id no.6所示的核苷酸序列，构建ppicz a-rhth1质粒。
15、作为本申请一些可选实施方式，所述基于如seq id no.4所示的核苷酸序列，构建ppic9k-fn10-mfp3质粒的步骤，包括：
16、基于如seq id no.4所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入质粒ppic9k上的酶切位点ecorⅰ和notⅰ之间，获得ppic9k-fn10-mfp3质粒。
17、作为本申请一些可选实施方式，所述基于如seq id no.6所示的核苷酸序列，构建ppicz a-rhth1质粒的步骤，包括：
18、基于如seq id no.6所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入ppicz a质粒上的酶切位点ecorⅰ和notⅰ之间，获得ppicz a-rhth1质粒。
19、作为本申请一些可选实施方式，所述制备感受态细胞，并将所述质粒电转化至所述感受态细胞，进行经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，包括：
20、制备gs115感受态细胞，并将所述ppic9k-fn10-mfp3质粒电转化至所述gs115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌。
21、作为本申请一些可选实施方式，所述制备gs115感受态细胞，并将所述ppic9k-fn10-mfp3质粒电转化至所述gs115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，包括：
22、制备gs115感受态细胞；
23、将所述ppic9k-fn10-mfp3质粒与所述gs115感受态细胞混合，冰浴后，进行电击，再加入山梨醇溶液，混合均匀后，转移至无菌ep管中进行静置孵育；孵育完成后，涂布于md固体平板进行倒置培养，直至长出单菌落；
24、向所述md固体平板加入无菌水后，获取含有其表面his+转化子的细胞悬液；将所述细胞悬液涂布于含有g418的ypd平板上，倒置培养至单菌落出现；将所述单菌落转移至含ypd培养基的培养板中进行培养和筛选，获得第一重组酵母工程菌。
25、作为本申请一些可选实施方式，所述制备感受态细胞，并将所述质粒电转化至所述感受态细胞，进行经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，还包括：
26、基于第一重组酵母工程菌制备重组菌株感受态细胞；将所述ppicz a-rhth1质粒电转化至所述重组菌株感受态细胞，获得第二重组酵母工程菌。
27、作为本申请一些可选实施方式，所述基于第一重组酵母工程菌制备重组菌株感受态细胞；将所述ppicz a-rhth1质粒电转化至所述重组菌株感受态细胞，获得第二重组酵母工程菌的步骤，包括：
28、基于第一重组酵母工程菌制备重组菌株感受态细胞；
29、将所述ppicz a-rhth1质粒和所述重组菌株感受态细胞混合，冰浴后，进行电击，再加入山梨醇溶液，混合均匀后，转移至无菌ep管中进行静置孵育；孵育完成后，涂布于md固体平板进行倒置培养，直至长出单菌落，获得第二重组酵母工程菌。
30、作为本申请一些可选实施方式，将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液；将所述诱导上清液纯化后，获得目标重组贻贝黏蛋白的步骤，包括：
31、将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液；
32、所述诱导上清液纯化后，进行体外修饰，获得修饰后的重组贻贝黏蛋白。
33、作为本申请一些可选实施方式，将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液的步骤，包括：
34、将所述重组酵母工程菌接种于bmgy诱导培养基中进行培养，培养至本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有天然活性的重组贻贝黏蛋白，其特征在于，将如SEQ ID No.3氨基酸序列所示的重组贻贝黏蛋白的工程菌株作为新宿主细胞，采用酪氨酸羟化酶进行羟化修饰后，获得目标重组贻贝黏蛋白；
2.根据权利要求1所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白，其特征在于，编码所述酪氨酸羟化酶的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
3.根据权利要求1所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白，其特征在于，所述重组贻贝黏蛋白是贻贝黏蛋白Mefp-3A和纤连蛋白主要结构域FN10序列串联获得的。
4.根据权利要求3所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白，其特征在于，所述贻贝黏蛋白Mefp-3A的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述纤连蛋白主要结构域FN10的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
5.根据权利要求1所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白，其特征在于，编码所述重组贻贝黏蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
6.一种如权利要求1-5任一项所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权
8.根据权利要求7所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，所述基于如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，构建pPIC9K-FN10-Mfp3质粒的步骤，包括：
9.根据权利要求7所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，所述基于如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，构建pPICZ A-rhTH1质粒的步骤，包括：
10.根据权利要求6所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备感受态细胞，并将所述质粒电转化至所述感受态细胞，进行经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，包括：
11.根据权利要求10所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备GS115感受态细胞，并将所述pPIC9K-FN10-Mfp3质粒电转化至所述GS115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，包括：
12.根据权利要求11所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备感受态细胞，并将所述质粒电转化至所述感受态细胞，进行经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，还包括：
13.根据权利要求12所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，所述基于第一重组酵母工程菌制备重组菌株感受态细胞；将所述pPICZ A-rhTH1质粒电转化至所述重组菌株感受态细胞，获得第二重组酵母工程菌的步骤，包括：
14.根据权利要求6所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液；将所述诱导上清液纯化后，获得目标重组贻贝黏蛋白的步骤，包括：
15.根据权利要求14所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液的步骤，包括：
16.根据权利要求14所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，所述诱导上清液纯化后，进行体外修饰，获得修饰后的重组贻贝黏蛋白的步骤，包括：
17.根据权利要求12所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液；将所述诱导上清液纯化后，获得目标重组贻贝黏蛋白的步骤，包括：
18.根据权利要求17所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，将所述第二重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液的步骤，包括：
19.根据权利要求17所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，将所述诱导上清液纯化后，获得目标重组贻贝黏蛋白的步骤，包括：
20.一种如权利要求1-5所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的应用，其特征在于，采用所述重组贻贝黏蛋白制备生物黏合剂。
...【技术特征摘要】
1.一种具有天然活性的重组贻贝黏蛋白，其特征在于，将如seq id no.3氨基酸序列所示的重组贻贝黏蛋白的工程菌株作为新宿主细胞，采用酪氨酸羟化酶进行羟化修饰后，获得目标重组贻贝黏蛋白；
2.根据权利要求1所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白，其特征在于，编码所述酪氨酸羟化酶的核苷酸序列如seq id no.6所示。
3.根据权利要求1所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白，其特征在于，所述重组贻贝黏蛋白是贻贝黏蛋白mefp-3a和纤连蛋白主要结构域fn10序列串联获得的。
4.根据权利要求3所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白，其特征在于，所述贻贝黏蛋白mefp-3a的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述纤连蛋白主要结构域fn10的氨基酸序列如seq id no.2所示。
5.根据权利要求1所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白，其特征在于，编码所述重组贻贝黏蛋白的核苷酸序列如seq id no.4所示。
6.一种如权利要求1-5任一项所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，所述获取目标核苷酸序列，构建质粒的步骤，包括：
8.根据权利要求7所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，所述基于如seq id no.4所示的核苷酸序列，构建ppic9k-fn10-mfp3质粒的步骤，包括：
9.根据权利要求7所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，所述基于如seq id no.6所示的核苷酸序列，构建ppicz a-rhth1质粒的步骤，包括：
10.根据权利要求6所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备感受态细胞，并将所述质粒电转化至所述感受态细胞，进行经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，包括：
11.根据权利要求10所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备gs115感受态细胞，并将所...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵俊，许高涛，李增，刘家炉，王蓉，孙同同，夏兵兵，许智勇，张勇，
申请(专利权)人：英特菲尔成都生物制品有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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