一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白及其制备方法与应用技术

本申请公开了一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白及其制备方法与应用，涉及基因工程技术领域。一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，编码所述融合蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.6所示。经过体外细胞验证，该融合蛋白具有比商品化胶原蛋白更明显的抑制炎症的效果，同时能够发挥明显的修护舒缓功效，可有效抗炎护肤，安全性高，避免了激素类抗炎产品长期使用所造成的皮肤屏障受损的问题。的皮肤屏障受损的问题。的皮肤屏障受损的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白及其制备方法与应用


[0001]本申请涉及基因工程
，特别涉及一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]胶原蛋白（Collagen，COL）是细胞外基质的主要组成成分，是体内含量最多、分布最广的蛋白质之一。其中，Ⅰ型胶原蛋白是以胶原纤维的形式发挥作用的，除了作为组织支持物赋予组织柔韧性，起到抗撕裂的保护作用外，对细胞、组织乃至整个机体的生理和病理过程也有影响。Ⅲ型胶原蛋白广泛存在于人体结缔组织中，如皮肤、肺、肝、肠和血管系统中，并且经常与Ⅰ型胶原分布在相同位置，Ⅲ型胶原蛋白对于心血管系统、肠和皮肤中正常Ⅰ型胶原纤维的生成是必不可少的；在皮肤中，Ⅲ型胶原可促进成纤维细胞生长及成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白，从而维持和修复皮肤弹性。目前，市场上销售的相关蛋白产品大多为动物组织中提取而非人源，可能无法与人体相容，会导致免疫排斥和过敏症状，同时具有潜在的携带病原体危害人体的风险，而重组人源蛋白大多为表达单一的胶原蛋白，大多数护肤产品中多添加人源化胶原蛋白，无法起到有效抗炎护肤的功效，而传统抗炎产品多为添加了激素来类抑制炎症，长时间使用还会造成皮肤屏障受损，损伤皮肤。

技术实现思路

[0003]本申请的主要目的是提供一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白及其制备方法与应用，旨在解决现有的蛋白产品抗炎护肤功效不足的技术问题。
[0004]为实现上述目的，本申请提出了一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，编码所述融合蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.6所示。
[0005]可选地，所述融合蛋白是经毕赤酵母表达的人胶原蛋白与人白细胞介素37的融合蛋白。
[0006]可选地，所述融合蛋白的氨基酸序列是由连接肽片段串联表达经过3次重复后的人源化
Ⅰ×Ⅲ
型胶原蛋白结构域片段和IL
‑
37成熟肽片段所得。
[0007]可选地，所述连接肽片段为（GGGGS）3。
[0008]可选地，所述人源化
Ⅰ×Ⅲ
型胶原蛋白结构域片段为将如Seq ID NO.1所示的人源Ⅰ型胶原蛋白肽片段和如Seq ID NO.2所示的人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段依次首尾相连所构成的胶原蛋白融合肽，所述胶原蛋白融合肽的氨基酸序列如Seq ID NO.3所示。
[0009]可选地，所述IL
‑
37成熟肽片段的氨基酸序列如Seq ID NO.4所示。
[0010]本申请还提出了一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列和毕赤酵母表达质粒pPIC9K，构建重组质粒pPIC9K
‑
Col
‑
IL37；制备GS115感受态细胞，并将所述重组质粒pPIC9K
‑
Col
‑
IL37电转化至所述GS115
感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌；将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清；将所述诱导上清纯化后，获得具有抗炎舒缓活性的融合蛋白Col
‑
IL37。
[0011]可选地，所述依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列和毕赤酵母表达质粒pPIC9K，构建重组质粒pPIC9K
‑
Col
‑
IL37的步骤，包括：依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入毕赤酵母表达质粒pPIC9K上的酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ之间，获得重组质粒pPIC9K
‑
Col
‑
IL37。
[0012]可选地，所述将所述重组质粒pPIC9K
‑
Col
‑
IL37电转化至所述GS115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，包括：将所述重组质粒pPIC9K
‑
Col
‑
IL37与所述GS115感受态细胞混合，冰浴后，进行电击，再加入山梨醇溶液，混匀后，转移至无菌EP管中，经30
°
C静置孵育1h
‑
2h后，涂布于MD固体平板，再经30℃倒置培养2d
‑
5d，直至长出单菌落；刮下所述MD固体平板上的His
+
转化子并进行稀释后，涂布于含有G418的YPD平板上，经30℃倒置培养至单菌落出现，再挑取所述YPD平板的单菌落转移至含YPD培养基的96孔培养板中，于30℃继续培养，以筛选重组酵母工程菌。
[0013]可选地，所述将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清的步骤，包括：挑取所述重组酵母工程菌接种于BMGY诱导培养基中，在30
º
C、220rpm的条件下培养24h至OD
600nm
吸光值达到2.0
‑
6.0；以3000rpm的转速离心10min后，收集菌体，重新接种于BMGY诱导培养基中，使OD
600nm
吸光值达到2.0，并在30
º
C、220rpm的条件下继续培养，并每24h添加0.5%的甲醇，诱导后，离心收集诱导上清。
[0014]可选地，所述将所述诱导上清纯化后，获得具有抗炎舒缓活性的融合蛋白Col
‑
IL37的步骤，包括：将所述诱导上清经过阳离子交换层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得具有抗炎舒缓活性的融合蛋白Col
‑
IL37。
[0015]本申请还提出了一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白在护肤品中的应用，采用上述具有抗炎舒缓活性的融合蛋白作为护肤品中的抗炎活性成分。
[0016]本申请基于基因重组技术，异源表达后获得具有抗炎舒缓活性的融合蛋白，其中，氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，针对不同宿主中基因的转录、翻译过程存在差异，对编码该融合蛋白的核苷酸序列进行优化设计，核苷酸序列如Seq ID NO.6所示，使该融合蛋白更易在表达系统中表达。不仅解决了天然蛋白分子量较大，难以从动物组织中异源提取，加工性较差，且蛋白纯度较低，成本较高，相关蛋白产品功效性有限的问题，而且能够减少对人体的排斥反应，规避潜在的携带病原体的风险，同时保留了天然蛋白的优良生物学性能。经过体外细胞验证，该融合蛋白具有比商品化胶原蛋白更明显的抑制炎症的效果，同时能够发挥明显的修护舒缓功效，可有效抗炎护肤，安全性高，避免了激素类抗炎产品长期使用所造成的皮肤屏障受损的问题。
附图说明
[0017]为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，编码所述融合蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.6所示。2.根据权利要求1所述的具有抗炎舒缓活性的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是经毕赤酵母表达的人胶原蛋白与人白细胞介素37的融合蛋白。3.根据权利要求1所述的具有抗炎舒缓活性的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列是由连接肽片段串联表达经过3次重复后的人源化
Ⅰ×Ⅲ
型胶原蛋白结构域片段和IL
‑
37成熟肽片段所得。4.根据权利要求3所述的具有抗炎舒缓活性的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽片段为（GGGGS）3。5.根据权利要求3所述的具有抗炎舒缓活性的融合蛋白，其特征在于，所述人源化
Ⅰ×Ⅲ
型胶原蛋白结构域片段为将如Seq ID NO.1所示的人源Ⅰ型胶原蛋白肽片段和如Seq ID NO.2所示的人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段依次首尾相连所构成的胶原蛋白融合肽，所述胶原蛋白融合肽的氨基酸序列如Seq ID NO.3所示。6.根据权利要求3所述的具有抗炎舒缓活性的融合蛋白，其特征在于，所述IL
‑
37成熟肽片段的氨基酸序列如Seq ID NO.4所示。7.一种如权利要求1
‑
6任一项所述的具有抗炎舒缓活性的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列和毕赤酵母表达质粒pPIC9K，构建重组质粒pPIC9K
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Col
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IL37；制备GS115感受态细胞，并将所述重组质粒pPIC9K
‑
Col
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IL37电转化至所述GS115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌；将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清；将所述诱导上清纯化后，获得具有抗炎舒缓活性的融合蛋白Col
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IL37。8.根据权利要求7所述的具有抗炎舒缓活性的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列和毕赤酵母表达质粒pPIC9K，构建重组质粒pPIC9K
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Col
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IL37的步骤，包括：依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入毕赤酵母表达质粒pPIC9K上的酶切位点EcoRⅠ和...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵俊，许高涛，李增，刘家炉，王蓉，何志远，凡玉芳，周炜，
申请(专利权)人：英特菲尔成都生物制品有限责任公司，
类型：发明
国别省市：