【技术实现步骤摘要】
本申请涉及基因工程，特别涉及一种长效耐热的超氧化物歧化酶及其制备方法与应用。
技术介绍
1、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，sod）是广泛存在于生物体内的金属酶，具有清除自由基的作用，如清除超氧因子离子自由基（o2-）。根据sod结合金属离子种类的不同，主要分为三类：第一类为cu/zn-sod，主要存在于真核细胞胞浆、叶绿体和过氧化物；第二类为mn-sod，主要存在于真核细胞线粒体和原核细胞中，第三类为fe-sod，主要存在于原核细胞中。sod具有抗衰、抗癌和防治白内障等作用。sod已在医药、食品和护肤品中进行广泛使用。
2、目前，sod的制备来源主要有植物、动物和微生物，市面上销售的sod产品大部分是从动物血液中提取的，由于原材料有限，纯化困难等原因，导致sod纯度低、产量少，人体使用后会有感染传染病的风险，虽然也有少量采用大肠杆菌、毕赤酵母和酿酒酵母系统来表达cu/zn-sod，但所获得的cu/zn-sod热稳定性差，容易失活或者活性降低，难以将cu/zn-sod用于功效性护肤品当中推向市场。
技术实现思路
1、本申请的主要目的是提供一种长效耐热的超氧化物歧化酶及其制备方法与应用，旨在解决现有的超氧化物歧化酶长效耐热性差的技术问题。
2、为实现上述目的，本申请提出了一种长效耐热的超氧化物歧化酶，所述超氧化物歧化酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，编码所述超氧化物歧化酶的核苷酸序列如seqid no.2所示。
4、本申请还提出了一种长效耐热的超氧化物歧化酶的制备方法，包括以下步骤：
5、依据如seq id no.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pyes2/ct-mfα，构建重组质粒pyes2/ct-mfα-sod；
6、将所述重组质粒pyes2/ct-mfα-sod转化入酿酒酵母invsc1感受态细胞，通过培养、pcr扩增、筛选，获得重组酵母工程菌invsc1/pyes2/ct-mfα-sod；
7、对所述重组酵母工程菌invsc1/pyes2/ct-mfα-sod进行诱导表达，并收集诱导产物；
8、将所述诱导产物纯化后，获得成品长效耐热的超氧化物歧化酶。
9、可选地，所述依据如seq id no.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pyes2/ct-mfα，构建重组质粒pyes2/ct-mfα-sod的步骤，包括：
10、依据如seq id no.2所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入酿酒酵母表达质粒pyes2/ct-mfα上的酶切位点not i和xba i之间，获得重组质粒pyes2/ct-mfα-sod。
11、可选地，所述将所述重组质粒pyes2/ct-mfα-sod转化入酿酒酵母invsc1感受态细胞，通过培养、pcr扩增、筛选，获得重组酵母工程菌invsc1/pyes2/ct-mfα-sod的步骤，包括：
12、将重组质粒pyes2/ct-mfα-sod加入酿酒酵母invscl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，进行电击转化，再加入山梨醇溶液，混匀后，孵育，离心后弃去上清，涂布在sc-u固体平板，经30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆菌落；
13、经菌液pcr筛选阳性克隆子invsc1/pyes2/ct-mfα-sod，获得重组酵母工程菌invsc1/pyes2/ct-mfα-sod。
14、可选地，所述对所述重组酵母工程菌invsc1/pyes2/ct-mfα-sod进行诱导表达，并收集诱导产物的步骤，包括：
15、挑取所述重组酵母工程菌invsc1/pyes2/ct-mfα-sod接种于sc-u诱导培养基中，使初始od600nm吸光值达到0.4；
16、在4℃、1500g的条件下离心5min，收集菌体，并取1ml-2ml的所述菌体重新接种于sc-u诱导培养基中，置于30℃下震荡培养94h-98h，再于4℃、15000g的条件下离心5min，收集诱导表达菌体和诱导上清；
17、将所述诱导上清经0.22μm滤膜过滤，得到诱导产物。
18、可选地，所述将所述诱导产物纯化后，获得成品长效耐热的超氧化物歧化酶的步骤，包括：
19、将所述诱导产物经过镍离子螯合亲和层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，获得成品长效耐热的超氧化物歧化酶。
20、本申请还提出了一种长效耐热的超氧化物歧化酶在护肤品中的应用，采用上述长效耐热的超氧化物歧化酶作为护肤品中的活性成分。
21、本申请通过基因重组及生物工程技术直接生产出结构稳定、具有生物学功能的超氧化物歧化酶，不仅解决了难以从动物血液中提取超氧化物歧化酶，纯化困难、产量少的缺点，而且能够减少排异反应，规避感染疾病的风险，同时保留了天然提取的超氧化物歧化酶的生物学性能，该长效耐热的超氧化物歧化酶比传统表达的单个超氧化物歧化酶分子量大，且不影响其生物学活性，其中，氨基酸序列如seq id no.1所示，针对不同宿主中基因的转录、翻译过程存在差异，对编码该超氧化物歧化酶的核苷酸序列进行优化设计，核苷酸序列如seq id no.2所示。
22、另外，本申请将不同sod的目的基因序列通过连接肽片段连接进行串联表达，可防止错误折叠，得到长效耐热的超氧化物歧化酶cu/zn-sod-linker-fe-sod，以保证两侧的sod完成各自独立的功能，由于极端嗜热菌aquifex pyrophilus可生长于67℃-95℃的环境中，其fe-sod具有很好的耐热性，通过将人的cu/zn-sod与极端嗜热菌aquifex pyrophilus的fe-sod进行融合表达，不仅保留了sod的生物学活性，避免在人体内引起感染，还增加了热稳定性，使得该长效耐热的超氧化物歧化酶在体内半衰期延长，相比于市售的sod产品，具有很好的长效性和耐热稳定性。
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1.一种长效耐热的超氧化物歧化酶，其特征在于，所述超氧化物歧化酶的氨基酸序列如Seq ID NO.1所示，编码所述超氧化物歧化酶的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的长效耐热的超氧化物歧化酶，其特征在于，所述超氧化物歧化酶是经酿酒酵母表达的人的Cu/Zn-SOD与极端嗜热菌aquifex pyrophilus的Fe-SOD的融合蛋白酶。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的长效耐热的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的长效耐热的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，所述依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα，构建重组质粒pYES2/CT-MFα-SOD的步骤，包括：
5.根据权利要求3所述的长效耐热的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，所述将所述重组质粒pYES2/CT-MFα-SOD转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-SOD
6.根据权利要求3所述的长效耐热的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，所述对所述重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-SOD进行诱导表达，并收集诱导产物的步骤，包括：
7.根据权利要求3所述的长效耐热的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，所述将所述诱导产物纯化后，获得成品长效耐热的超氧化物歧化酶的步骤，包括：
8.一种长效耐热的超氧化物歧化酶在护肤品中的应用，其特征在于，采用如权利要求1-2任一项所述的长效耐热的超氧化物歧化酶作为护肤品中的活性成分。
...【技术特征摘要】
1.一种长效耐热的超氧化物歧化酶，其特征在于，所述超氧化物歧化酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，编码所述超氧化物歧化酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。
2.根据权利要求1所述的长效耐热的超氧化物歧化酶，其特征在于，所述超氧化物歧化酶是经酿酒酵母表达的人的cu/zn-sod与极端嗜热菌aquifex pyrophilus的fe-sod的融合蛋白酶。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的长效耐热的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的长效耐热的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，所述依据如seq id no.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pyes2/ct-mfα，构建重组质粒pyes2/ct-mfα-sod的步骤，包括：
5.根据权利要求3...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵俊，夏兵兵，李增，刘家炉，何志远，周炜，蒋敏之，张甜甜，
申请(专利权)人：英特菲尔成都生物制品有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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