一种具有修复活性的重组纤连-胶原融合蛋白及其制备方法与应用技术

本申请公开了一种具有修复活性的重组纤连

【技术实现步骤摘要】
一种具有修复活性的重组纤连
‑
胶原融合蛋白及其制备方法与应用


[0001]本申请涉及基因工程
，特别涉及一种具有修复活性的重组纤连
‑
胶原融合蛋白及其制备方法与应用
。

技术介绍

[0002]纤连蛋白（
Fibronectin
，
FN
），也称纤维连接蛋白，具有多种生物学功能
。
纤连蛋白广泛存在于动物组织和组织液中，是一种大分子糖蛋白，分子量约为
450kDa
，具有多种生物活性
。
纤连蛋白可以结合细胞表面和各种化合物，包括胶原
、
纤维蛋白
、
肝素
、DNA
和肌动蛋白，参与细胞粘附
、
细胞运动
、
调理作用
、
伤口愈合和细胞形状的维持
。
纤连蛋白可以与细胞表面的整合素
α
v
β3结合，增强血小板附着
、
吞噬细胞和成纤维细胞迁移以及细胞增殖，增强其粘附力
。
纤连蛋白是成纤维细胞的重要趋化因子，可通过帮助维持细胞骨架结构来增强细胞的粘附和趋化
。
纤连蛋白还通过刺激内皮细胞迁移增强新生血管的形成
。
故纤连蛋白在皮肤中起到的是维护皮肤屏障的功效，外源补充纤连蛋白可以修复皮肤屏障
。
而胶原蛋白也是与美容护肤
、
组织再生关系最为紧密的成分，一方面胶原蛋白组成纤维，从而构成细胞外基质的三维结构，为细胞提供生存空间，支撑组织的生理形态；另一方面，其所构建的三维结构可以通过生物力转导从而调控细胞的粘附
、
增殖和分化以及免疫细胞的免疫应答等行为，从而调控组织再生
。
目前，市场上销售的相关蛋白产品大多为动物组织中提取而非人源，可能无法与人体相容，会导致免疫排斥和过敏症状，同时具有潜在的携带病原体危害人体的风险
。
而重组人源蛋白大多为表达单一的胶原蛋白或者纤连蛋白，暂无表达胶原蛋白融合纤连蛋白的相关产品；且无论是胶原蛋白还是纤连蛋白，其修复活性都有待提高
。

技术实现思路

[0003]本申请的主要目的是提供一种具有修复活性的重组纤连
‑
胶原融合蛋白及其制备方法与应用，旨在解决现有的蛋白产品表达单一的技术问题
。
[0004]为实现上述目的，本申请提出了一种具有修复活性的重组纤连
‑
胶原融合蛋白，所述重组纤连
‑
胶原融合蛋白的氨基酸序列如
Seq ID NO.5
所示，编码所述重组纤连
‑
胶原融合蛋白的核苷酸序列如
Seq ID NO.6
所示
。
[0005]可选地，所述重组纤连
‑
胶原融合蛋白是经酿酒酵母表达的类人胶原蛋白与类人纤连蛋白的融合蛋白
。
[0006]可选地，所述重组纤连
‑
胶原融合蛋白的氨基酸序列是由连接肽片段串联表达人源化
Ⅱ×Ⅲ
型胶原蛋白功能区片段和纤连蛋白功能区片段所得
。
[0007]可选地，所述连接肽片段为（
G4S
）3。
[0008]可选地，所述人源化
Ⅱ×Ⅲ
型胶原蛋白功能区片段为将如
Seq ID NO.1
所示的人源Ⅱ型胶原蛋白肽片段和如
Seq ID NO.2
所示的人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段依次首尾相连所构成的胶原蛋白融合肽，所述胶原蛋白融合肽的氨基酸序列如
Seq ID NO.3
所示
。
[0009]可选地，所述纤连蛋白功能区片段为人源纤连蛋白中第Ⅲ型结构域中重复单元
C
端的一个功能片段，所述纤连蛋白功能区片段的氨基酸序列如
Seq ID NO.4
所示
。
[0010]本申请还提出了一种具有修复活性的重组纤连
‑
胶原融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：依据如
Seq ID NO.6
所示的核苷酸序列，构建
pYES2/CT
‑
MF
α
‑
C23
‑
FNp
重组质粒；将所述
pYES2/CT
‑
MF
α
‑
C23
‑
FNp
重组质粒转化入酿酒酵母
INVSc1
感受态细胞，通过培养
、PCR
扩增
、
筛选，获得重组酵母工程菌；对所述重组酵母工程菌进行诱导表达，并收集诱导上清；将所述诱导上清纯化后，获得重组纤连
‑
胶原融合蛋白
。
[0011]可选地，所述依据如
Seq ID NO.6
所示的核苷酸序列，构建
pYES2/CT
‑
MF
α
‑
C23
‑
FNp
重组质粒的步骤，包括：依据如
Seq ID NO.6
所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入
pYES2/CT
‑
Mf
α
质粒上的酶切位点
Not
ꢀⅠ
和
Xba
ꢀⅠ
之间，获得
pYES2/CT
‑
MF
α
‑
C23
‑
FNp
重组质粒
。
[0012]可选地，所述将所述
pYES2/CT
‑
MF
α
‑
C23
‑
FNp
重组质粒转化入酿酒酵母
INVSc1
感受态细胞，通过培养
、PCR
扩增
、
筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，包括：将重组质粒
pYES2/CT
‑
MF
α
‑
C23
‑
FNp
加入酿酒酵母
INVScl
感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，进行电击转化，再加入山梨醇溶液，混匀后，孵育，离心后弃去上清，涂布在
SC
‑
U
固体平板，经
30℃
恒温倒置培养，直至长出单克隆菌落；经菌液
PCR
筛选阳性克隆株，获得重组酵母工程菌
。
[0013]可选地，所述对所述重组酵母工程菌进行诱导表达，并收集诱导上清的步骤，包括：挑取所述重组酵母工程菌单菌落接种于
SC
‑
U
诱导培养基中，使初始
OD
600nm...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种具有修复活性的重组纤连
‑
胶原融合蛋白，其特征在于，所述重组纤连
‑
胶原融合蛋白的氨基酸序列如
Seq ID NO.5
所示，编码所述重组纤连
‑
胶原融合蛋白的核苷酸序列如
Seq ID NO.6
所示
。2.
根据权利要求1所述的具有修复活性的重组纤连
‑
胶原融合蛋白，其特征在于，所述重组纤连
‑
胶原融合蛋白是经酿酒酵母表达的类人胶原蛋白与类人纤连蛋白的融合蛋白
。3.
根据权利要求1所述的具有修复活性的重组纤连
‑
胶原融合蛋白，其特征在于，所述重组纤连
‑
胶原融合蛋白的氨基酸序列是由连接肽片段串联表达人源化
Ⅱ×Ⅲ
型胶原蛋白功能区片段和纤连蛋白功能区片段所得
。4.
根据权利要求3所述的具有修复活性的重组纤连
‑
胶原融合蛋白，其特征在于，所述连接肽片段为（
G4S
）3。5.
根据权利要求3所述的具有修复活性的重组纤连
‑
胶原融合蛋白，其特征在于，所述人源化
Ⅱ×Ⅲ
型胶原蛋白功能区片段为将如
Seq ID NO.1
所示的人源Ⅱ型胶原蛋白肽片段和如
Seq ID NO.2
所示的人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段依次首尾相连所构成的胶原蛋白融合肽，所述胶原蛋白融合肽的氨基酸序列如
Seq ID NO.3
所示
。6.
根据权利要求3所述的具有修复活性的重组纤连
‑
胶原融合蛋白，其特征在于，所述纤连蛋白功能区片段为人源纤连蛋白中第Ⅲ型结构域中重复单元
C
端的一个功能片段，所述纤连蛋白功能区片段的氨基酸序列如
Seq ID NO.4
所示
。7.
一种如权利要求1‑6任一项所述的具有修复活性的重组纤连
‑
胶原融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：依据如
Seq ID NO.6
所示的核苷酸序列，构建
pYES2/CT
‑
MF
α
‑
C23
‑
FNp
重组质粒；将所述
pYES2/CT
‑
MF
α
‑
C23
‑
FNp
重组质粒转化入酿酒酵母
INVSc1
感受态细胞，通过培养
、PCR
扩增
、
筛选，获得重组酵母工程菌；对所述重组酵母工程菌进行诱导表达，并收集诱导上清；将所述诱导上清纯化后，获得重组纤连
‑
胶原融合蛋白
。8.
根据权利要求7所述的具有修复活性的重组纤连
‑
胶原融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述依据如
Seq ID NO.6
所示的核苷酸序列，构建
pYES2/CT
‑
MF

【专利技术属性】
技术研发人员：赵俊，许高涛，李增，刘家炉，何志远，吴博，张勇，许智勇，蒋敏之，
申请(专利权)人：英特菲尔成都生物制品有限责任公司，
类型：发明
国别省市：