一种长效耐热胶原蛋白及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种长效耐热胶原蛋白及其制备方法与应用，涉及基于工程技术领域。一种长效耐热胶原蛋白，包括具有如Seq ID NO.1所示的氨基酸序列的胶原蛋白，编码所述胶原蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。本发明专利技术基于人胶原蛋白序列优化，异源表达后获得重组人源化胶原蛋白，本发明专利技术的胶原蛋白不易产生毒素，使用更加安全，且具有比商品化的天然人胶原蛋白更好的耐热性和一定的长效性，而且不影响促细胞增殖、细胞粘附活性、促细胞迁移活性的生物学活性，可在市场中推广使用。可在市场中推广使用。可在市场中推广使用。

【技术实现步骤摘要】
一种长效耐热胶原蛋白及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种长效耐热胶原蛋白及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是由三股多肽链相互咬合缠绕形成长且坚韧的三螺旋结构。胶原蛋白的类型因其三条α链的组合不同而各不相同，一级结构分析表明三螺旋域的最大特点是氨基酸呈现（Gly
‑
X
‑
Y）
n
周期性重复排列，其中X位置通常为脯氨酸（Pro），Ｙ通常为羟脯氨酸（Hyp）和羟赖氨酸（Hyl），而后两种氨基酸在其他蛋白质中很少见。市场上所售的胶原蛋白主要是利用化学方法和酶解法处理动物组织或器官获得的天然胶原蛋白，这种天然胶原蛋白在处理加工过程中，容易破坏蛋白的天然结构且易降解，最终生物学活性丧失。此外，不同种属来源胶原蛋白的蛋白氨基酸序列差异较大，人体使用时也容易产生免疫排斥和过敏症状。而目前的重组人源化胶原蛋白大部分使用大肠埃希菌和巴斯德毕赤酵母表达系统，其所提取的胶原蛋白耐热性差，难以在市场中推广。

技术实现思路

[0003]本专利技术的主要目的是提供一种长效耐热胶原蛋白及其制备方法与应用，旨在解决现有的天然胶原蛋白耐热性差的技术问题。
[0004]为实现上述目的，本专利技术提出了一种长效耐热胶原蛋白，包括具有如Seq ID NO.1所示的氨基酸序列的胶原蛋白，编码所述胶原蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。
[0005]可选地，所述胶原蛋白的核苷酸序列是经酿酒酵母密码子优化Ⅰ型胶原蛋白的核苷酸序列与Ⅲ型胶原蛋白的核苷酸序列后得到的。
[0006]可选地，所述优化Ⅰ型胶原蛋白的核苷酸序列与Ⅲ型胶原蛋白的核苷酸序列的方式，包括：由Ⅰ型胶原蛋白的核苷酸序列与Ⅲ型胶原蛋白的核苷酸序列进行串联重复3次后，用一段柔性连接肽连接在人白蛋白第三结构域N端后进行人工设计。
[0007]可选地，所述长效耐热胶原蛋白还包括对所述胶原蛋白进行修饰的脂质体。
[0008]可选地，所述胶原蛋白的核苷酸序列包括Not I酶切位点、Xba I酶切位点、起始密码子、终止密码子及6
×
His标签序列。
[0009]本专利技术还提出了一种长效耐热胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pYES2/CT
‑
MFα，构建重组质粒pYES2/CT
‑
MFα
‑
Col
Ⅰ‑
Col
Ⅲ‑
3DHSA；将所述重组质粒pYES2/CT
‑
MFα
‑
Col
Ⅰ‑
Col
Ⅲ‑
3DHSA转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组工程菌INVSc1/pYES2/CT
‑
MFα
‑
Col
Ⅰ‑
Col
Ⅲ‑
3DHSA；通过对所述重组工程菌INVSc1/pYES2/CT
‑
MFα
‑
Col
Ⅰ‑
Col
Ⅲ‑
3DHSA诱导表达，获得
诱导产物；将所述诱导产物纯化后，获得胶原蛋白；对所述胶原蛋白进行脂质体包裹，获得长效耐热胶原蛋白。
[0010]可选地，所述依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pYES2/CT
‑
MFα，构建重组质粒pYES2/CT
‑
MFα
‑
Col
Ⅰ‑
Col
Ⅲ‑
3DHSA的步骤，包括：将如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列经过人工合成，插入酿酒酵母表达质粒pYES2/CT
‑
MFα上的酶切位点Not I和Xba I之间，获得重组质粒pYES2/CT
‑
MFα
‑
Col
Ⅰ‑
Col
Ⅲ‑
3DHSA。
[0011]可选地，所述将所述重组质粒pYES2/CT
‑
MFα
‑
Col
Ⅰ‑
Col
Ⅲ‑
3DHSA转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组工程菌INVSc1/pYES2/CT
‑
MFα
‑
Col
Ⅰ‑
Col
Ⅲ‑
3DHSA的步骤，包括：将重组质粒pYES2/CT
‑
MFα
‑
Col
Ⅰ‑
Col
Ⅲ‑
3DHSA加入酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，再加入山梨醇溶液，混匀，进行电击转化，在SC
‑
U选择培养基上涂平板，经30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆；经菌液PCR筛选阳性克隆子INVSc1/pYES2/CT
‑
MFα
‑
Col
Ⅰ‑
Col
Ⅲ‑
3DHSA，获得重组工程菌INVSc1/pYES2/CT
‑
MFα
‑
Col
Ⅰ‑
Col
Ⅲ‑
3DHSA。
[0012]可选地，所述通过对所述重组工程菌INVSc1/pYES2/CT
‑
MFα
‑
Col
Ⅰ‑
Col
Ⅲ‑
3DHSA诱导表达，获得诱导产物的步骤，包括：挑取所述重组工程菌INVSc1/pYES2/CT
‑
MFα
‑
Col
Ⅰ‑
Col
Ⅲ‑
3DHSA接种于SC
‑
U诱导培养基中，使初始OD
600nm
吸光值达到0.4；在4℃、1500g的条件下离心5min，收集菌体，并取1ml
‑
2ml的所述菌体重新接种于SC
‑
U诱导培养基中，置于30℃下震荡培养94h
‑
98h，再于4℃、15000g的条件下离心5min，收集诱导表达菌体和上清蛋白液；将所述上清蛋白液经0.22μm滤膜过滤，得到分子量为45kDa的诱导产物。
[0013]可选地，所述将所述诱导产物纯化后，获得胶原蛋白的步骤，包括：将所述诱导产物经过镍离子螯合亲和层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得胶原蛋白。
[0014]可选地，所述对所述胶原蛋白进行脂质体包裹，获得长效耐热胶原蛋白的步骤，包括：将卵磷脂、胆固醇和维生素E溶解于无水乙醇中，经剪切、均质、减压蒸发后，得到脂质体薄膜；在所述脂质体薄膜中加入聚山梨酯80水溶液进行水化，再剪切、纯化、破膜后，得到脂质体；将所述脂质体与所述胶原蛋白超声混合后，再经过过滤、干燥，得到长本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种长效耐热胶原蛋白，其特征在于，包括具有如Seq ID NO.1所示的氨基酸序列的胶原蛋白，编码所述胶原蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的长效耐热胶原蛋白，其特征在于，所述胶原蛋白的核苷酸序列是经酿酒酵母密码子优化Ⅰ型胶原蛋白的核苷酸序列与Ⅲ型胶原蛋白的核苷酸序列后得到的。3.根据权利要求2所述的长效耐热胶原蛋白，其特征在于，所述优化Ⅰ型胶原蛋白的核苷酸序列与Ⅲ型胶原蛋白的核苷酸序列的方式，包括：由Ⅰ型胶原蛋白的核苷酸序列与Ⅲ型胶原蛋白的核苷酸序列进行串联重复3次后，用一段柔性连接肽连接在人白蛋白第三结构域N端后进行人工设计。4.根据权利要求3所述的长效耐热胶原蛋白，其特征在于，所述长效耐热胶原蛋白还包括对所述胶原蛋白进行修饰的脂质体。5.根据权利要求1所述的长效耐热胶原蛋白，其特征在于，所述胶原蛋白的核苷酸序列包括Not I酶切位点、Xba I酶切位点、起始密码子、终止密码子及6
×
His标签序列。6.一种如权利要求4
‑
5任一项所述的长效耐热胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pYES2/CT
‑
MFα，构建重组质粒pYES2/CT
‑
MFα
‑
Col
Ⅰ‑
Col
Ⅲ‑
3DHSA；将所述重组质粒pYES2/CT
‑
MFα
‑
Col
Ⅰ‑
Col
Ⅲ‑
3DHSA转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组工程菌INVSc1/pYES2/CT
‑
MFα
‑
Col
Ⅰ‑
Col
Ⅲ‑
3DHSA；通过对所述重组工程菌INVSc1/pYES2/CT
‑
MFα
‑
Col
Ⅰ‑
Col
Ⅲ‑
3DHSA诱导表达，获得诱导产物；将所述诱导产物纯化后，获得胶原蛋白；对所述胶原蛋白进行脂质体包裹，获得长效耐热胶原蛋白。7.根据权利要求6所述的长效耐热胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pYES2/CT
‑
MFα，构建重组质粒pYES2/CT
‑
MFα
‑
Col
Ⅰ‑
Col
Ⅲ‑
3DHSA的步骤，包括：将如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列经过人工合成，插入酿酒酵母表达质粒pYES2/CT
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MFα上的酶切位点Not I和Xba I之间，获得重组质粒pYES2/CT
‑
MFα
‑
Col
Ⅰ‑
Col
Ⅲ‑
3DHSA。8.根据权利要求6所述的长效耐热胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述将所述重组质粒pYES2/CT
‑
MFα
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【专利技术属性】
技术研发人员：赵俊，夏兵兵，李增，朱何龙，何志远，凡玉芳，周炜，蒋敏之，张甜甜，
申请(专利权)人：英特菲尔成都生物制品有限责任公司，
类型：发明
国别省市：