【技术实现步骤摘要】
本申请涉及基因工程，特别涉及重组人源化胶原蛋白标准品及其制备方法、鉴定方法与应用。
技术介绍
1、目前，市场上现有胶原蛋白标准品有较多的缺点。如来源限制，传统的胶原蛋白标准品通常来自动物组织，如牛皮、鱼鳞等；这样的来源限制导致了供应的不稳定性和可持续性的问题；此外，动物源性胶原蛋白还存在批次差异和质量不一致的可能性。再如污染风险，传统胶原蛋白标准品的制备过程中可能存在污染物的引入，如病原体、有害化学物质或其他微生物；这些污染物可能对研究结果产生干扰，影响实验的准确性和可重复性。再如缺乏一致性，由于传统方法提取的胶原蛋白通常是多种类型和结构的混合物，其组成和特性可能会因来源和制备方法的不同而有很大的变异；这导致了胶原蛋白标准品的一致性较差，难以比较不同实验室或研究之间的结果。再如限制功能研究，传统胶原蛋白标准品的来源和组成限制了其在功能研究中的应用；例如，在细胞培养和组织工程等领域，动物源性胶原蛋白可能不够理想，因为它们可能存在免疫原性、批次差异和生物活性不稳定等问题。再如难以定制，传统的胶原蛋白标准品很难进行定制化设计，以满足特定应用的需求。
2、即，由于目前市场上缺乏高纯度、稳定性和一致性的胶原蛋白标准品，这给相关研究和应用带来了困扰，这限制了胶原蛋白的进一步开发和应用，尤其是在组织工程、再生医学和生物材料领域。
技术实现思路
1、本申请的主要目的是提供重组人源化胶原蛋白标准品及其制备方法、鉴定方法与应用，旨在解决现有方法中缺乏重组人源化胶原蛋白标准品的技术问题。p>
2、为实现上述目的，本申请第一种实施例提出了：重组人源化胶原蛋白标准品，所述重组人源化胶原蛋白标准品的核苷酸序列是通过酵母密码子优化人胶原蛋白的核苷酸序列获得的，所述重组人源化胶原蛋白标准品的核苷酸序列如seq id no.1所示。
3、作为本申请一些可选实施方式，所述重组人源化胶原蛋白标准品的核苷酸序列包括not i酶切位点、xba i酶切位点、起始密码子、终止密码子及6×his标签序列；所述not i酶切位点的核苷酸序列为gcggccgc；所述xba i酶切位点的核苷酸序列为tctaga；所述起始密码子的核苷酸序列为atg；所述终止密码子的核苷酸序列为taa。
4、作为本申请一些可选实施方式，所述重组人源化胶原蛋白标准品的氨基酸序列如seq id no.2所示。
5、作为本申请一些可选实施方式，所述重组人源化胶原蛋白标准品的氨基酸序列包括基本重复单元及末端氨基酸序列；所述基本重复单元为人iii型胶原肽段，所述人iii型胶原肽段的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述末端氨基酸序列为人ii型胶原肽段，所述人ii型胶原肽段的氨基酸序列如seq id no.4所示。
6、为实现上述目的，本申请第二种实施例还提出了：一种如上所述重组人源化胶原蛋白标准品的制备方法，包括以下步骤：
7、设计重组人源化胶原蛋白标准品的核苷酸序列，所述重组人源化胶原蛋白标准品的核苷酸序列如seq id no.1所示；基于所述重组人源化胶原蛋白标准品的核苷酸序列，构建重组pyes2/ct-mfα-cols质粒；
8、将所述重组pyes2/ct-mfα-cols质粒电转化入酿酒酵母invsc1感受态细胞，经过诱导表达后，收集诱导上清液；
9、将所述诱导上清液纯化后，获得人源化胶原蛋白原液；
10、基于所述人源化胶原蛋白原液，制备获得重组人源化胶原蛋白标准品。
11、作为本申请一些可选实施方式，所述基于所述重组人源化胶原蛋白标准品的核苷酸序列，构建重组pyes2/ct-mfα-cols质粒的步骤，包括：
12、基于如seq id no.1所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段通过not i 和xba i的酶切位点插入酿酒酵母表达质粒pyes2/ct-mfα中，获得重组pyes2/ct-mfα-cols质粒。
13、作为本申请一些可选实施方式，所述将所述重组pyes2/ct-mfα-cols质粒电转化入酿酒酵母invsc1感受态细胞的步骤，包括：
14、取10μl的所述重组pyes2/ct-mfα-cols质粒加到80μl酿酒酵母invsc1感受态细胞中，混匀后转移到预冷的电击杯中，冰上静置5min；将bio-rad电转化仪调至真菌档，将所述电击杯置于bio-rad电转化仪上进行电击转化；
15、电击转化结束后，向所述电击杯中加入500μl预冷的1m山梨醇溶液，混合均匀，30℃孵育1h；
16、孵育结束后，进行离心处理，并在离心后弃去400-500μl上清液，吹匀后涂布在sc-u选择培养基；将所述 sc-u选择培养基倒置于30 ℃恒温培养，直至长出单克隆菌落；
17、挑取所述 sc-u选择培养基上生长的单克隆菌落，接入到装有500μl ypd液体培养基离心管中，在30℃和180r/min的培养条件下进行过夜培养；过夜培养结束后，挑选10株克隆，分别提取基因组dna；
18、利用引物对基因组dna进行pcr处理，获得pcr产物；所述pcr条件为：98℃预变性5min，98℃热变性50s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃复性10min。
19、作为本申请一些可选实施方式，所述引物上游引物f：5'-gtatcccgggtgaaaaaggc-3'，下游引物r：5'-tgatgaccaccaccacaacat-3'
20、作为本申请一些可选实施方式，所述ypd液体培养基为酵母提取物10g/l、蛋白胨20g/l和葡萄糖20g/l；
21、所述 sc-u选择培养基为ynb无氨基酸氮源6.7g/l、氨基酸混合物i 1g/l、氨基酸混合物ⅱ 0.5g/l和葡萄糖20g/l；其中，所述氨基酸混合物i包括精氨酸、亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸和腺嘌呤；所述氨基酸混合物ⅱ包括天冬氨酸、丝氨酸、组氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸。
22、作为本申请一些可选实施方式，所述经过诱导表达后，收集诱导上清液的步骤，包括：
23、挑取单菌落接种于20 ml sc-u选择培养基，经30℃、220 rpm振荡培养过夜，获得菌液；测定其od600吸光值，将菌液转接至于100 ml sc-u诱导培养基中，使得初始od600≈0.4继续培养，每24h向培养基中添加半乳糖至诱导完成；诱导完成后分别取菌液进行离心，离心后收集诱导上清液；所述sc-u诱导培养基为酵母提取物10g/l、蛋白胨20g/l和葡萄糖20g/l。
24、作为本申请一些可选实施方式，所述将所述诱导上清液纯化后，获得人源化胶原蛋白原液的步骤，包括：
25、使用gehealthcare公司chelatingsepharosetmfastflow镍离子螯合亲和层析填料，用3个柱体积的纯化水清洗ni本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.重组人源化胶原蛋白标准品，其特征在于，所述重组人源化胶原蛋白标准品的核苷酸序列是通过酵母密码子优化人胶原蛋白的核苷酸序列获得的，所述重组人源化胶原蛋白标准品的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述重组人源化胶原蛋白标准品，其特征在于，所述重组人源化胶原蛋白标准品的核苷酸序列包括Not I酶切位点、Xba I酶切位点、起始密码子、终止密码子及6×His标签序列；所述Not I酶切位点的核苷酸序列为GCGGCCGC；所述Xba I酶切位点的核苷酸序列为TCTAGA；所述起始密码子的核苷酸序列为ATG；所述终止密码子的核苷酸序列为TAA。
3.根据权利要求1所述重组人源化胶原蛋白标准品，其特征在于，所述重组人源化胶原蛋白标准品的氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述重组人源化胶原蛋白标准品，其特征在于，所述重组人源化胶原蛋白标准品的氨基酸序列包括基本重复单元及末端氨基酸序列；所述基本重复单元为人III型胶原肽段，所述人III型胶原肽段的氨基酸序列如Seq ID NO.3所示；所述末端氨基酸序列为
5.一种如权利要求1-4任一项所述重组人源化胶原蛋白标准品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述重组人源化胶原蛋白标准品的制备方法，其特征在于，所述基于所述重组人源化胶原蛋白标准品的核苷酸序列，构建重组pYES2/CT-MFα-Cols质粒的步骤，包括：
7.根据权利要求5所述重组人源化胶原蛋白标准品的制备方法，其特征在于，所述将所述重组pYES2/CT-MFα-Cols质粒电转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞的步骤，包括：
8.根据权利要求7所述重组人源化胶原蛋白标准品的制备方法，其特征在于，所述引物上游引物F：5'-GTATCCCGGGTGAAAAAGGC-3'，下游引物R：5'-TGATGACCACCACCACAACAT-3'。
9.根据权利要求7所述重组人源化胶原蛋白标准品的制备方法，其特征在于，所述YPD液体培养基为酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L和葡萄糖20g/L；
10.根据权利要求5所述重组人源化胶原蛋白标准品的制备方法，其特征在于，所述经过诱导表达后，收集诱导上清液的步骤，包括：
11.根据权利要求5所述重组人源化胶原蛋白标准品的制备方法，其特征在于，所述将所述诱导上清液纯化后，获得人源化胶原蛋白原液的步骤，包括：
12.根据权利要求5所述重组人源化胶原蛋白标准品的制备方法，其特征在于，所述基于所述人源化胶原蛋白原液，制备获得重组人源化胶原蛋白标准品的步骤，包括：
13.一种如权利要求1-4任一项所述重组人源化胶原蛋白标准品的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
14.一种如权利要求1-4任一项所述重组人源化胶原蛋白标准品的应用，其特征在于，将所述重组人源化胶原蛋白标准品应用于制备医用材料和生物护肤。
...【技术特征摘要】
1.重组人源化胶原蛋白标准品，其特征在于，所述重组人源化胶原蛋白标准品的核苷酸序列是通过酵母密码子优化人胶原蛋白的核苷酸序列获得的，所述重组人源化胶原蛋白标准品的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.根据权利要求1所述重组人源化胶原蛋白标准品，其特征在于，所述重组人源化胶原蛋白标准品的核苷酸序列包括not i酶切位点、xba i酶切位点、起始密码子、终止密码子及6×his标签序列；所述not i酶切位点的核苷酸序列为gcggccgc；所述xba i酶切位点的核苷酸序列为tctaga；所述起始密码子的核苷酸序列为atg；所述终止密码子的核苷酸序列为taa。
3.根据权利要求1所述重组人源化胶原蛋白标准品，其特征在于，所述重组人源化胶原蛋白标准品的氨基酸序列如seq id no.2所示。
4.根据权利要求3所述重组人源化胶原蛋白标准品，其特征在于，所述重组人源化胶原蛋白标准品的氨基酸序列包括基本重复单元及末端氨基酸序列；所述基本重复单元为人iii型胶原肽段，所述人iii型胶原肽段的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述末端氨基酸序列为人ii型胶原肽段，所述人ii型胶原肽段的氨基酸序列如seq id no.4所示。
5.一种如权利要求1-4任一项所述重组人源化胶原蛋白标准品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述重组人源化胶原蛋白标准品的制备方法，其特征在于，所述基于所述重组人源化胶原蛋白标准品的核苷酸序列，构建重组pyes2...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵俊，吴博，李增，刘家炉，王蓉，夏兵兵，周炜，何志远，蒋敏之，
申请(专利权)人：英特菲尔成都生物制品有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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