【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种利用严谨诱导型pcas启动子构建表达调控系统的方法。
技术介绍
1、基因表达的转录调控在微生物实验中是无法避免的关键环节，涉及着诸多水平的调控。除了基因本身拷贝数等因素的基因水平调节外，更为主要的调控则包括转录水平、转录后水平以及翻译水平等层面。这些层面在时空顺序中先后对目标基因的表达起到调控目的。然而由于该调控过程极为复杂，难以严谨调控，很大程度上限制了相关基因的功能探究等研究。
2、尽管不同原核或真核细胞的表达调控系统取得了一定进步，但目前的调控系统仍存在一定的局限性。常用的诱导型启动子有乳糖诱导启动子plac、l-阿拉伯糖诱导的ara-pbad启动子等。使用该类诱导型启动子，不添加诱导物时，会阻遏蛋白和调控序列结合，使得启动子无法工作。而在菌株中，由于阻遏蛋白表达量较低，无法完全结合到调控序列以至于出现渗透表达现象，无法满足绝对严谨要求。其表达调控系统诱导过程缓慢、缺乏诱导特异性和表达量的精准滴度控制等，在实际应用中，生物合成途径中某些基因的表达，需要对表达时间和表达量进行十分严谨的控制，而目前已知的启动子很难实现这一点，限制了表达系统的应用。
3、因此，一种利用严谨诱导型pcas启动子构建表达调控系统的方法亟待提出。
技术实现思路
1、为解决现有技术存在的缺陷，本专利技术提供一种利用严谨诱导型pcas启动子构建表达调控系统的方法，目的在于解决现有技术中的部分问题或至少缓解部分缺陷。
2、为了解决上述技术问题
3、本专利技术提供一种利用严谨诱导型pcas启动子构建表达调控系统的方法，包括以下步骤：
4、s1、在野生型大肠杆菌k-12的基础上，替换菌株中casa的pcas启动子序列，同时敲除吸收利用阿拉伯糖的arabad操纵子序列；
5、s2、以pez15a为原始质粒，利用gibson组装将pcas启动子+gfp报告基因和ara-pbad启动子+leuo基因结合结构域基因连接，得到报告质粒；
6、s3、通过流式细胞仪检测含有不同报告质粒的菌株的荧光发光情况，验证表达系统的绝对严谨性，完成pcas转录调控系统的构建。
7、优选的，在所述步骤s1中：利用λred系统同源重组的方法替换和敲除菌株中casa基因的pcas启动子序列和arabad操纵子序列。
8、优选的，在所述步骤s2中：将待表达基因替换gfp报告基因，插入已构建好的报告质粒进行表达。
9、优选的，在所述步骤s2中：所述pcas启动子的核苷酸序列如seq id no.17所示，leuo基因的核苷酸序列如seq id no.18所示，ara-pbad启动子的核苷酸序列如seq idno.19所示，arac基因的核苷酸序列如seq id no.20所示，gfp报告基因的核苷酸序列如seqid no.21所示。
10、优选的，所述步骤s3中选用绿色荧光蛋白gfp作为报告基因，以此构建报告质粒，最终通过流式细胞仪统计群体细胞中的发光细胞百分比，以表征不同启动子的表达情况和渗漏水平。
11、本专利技术相较于现有技术，具有以下有益效果：
12、本专利技术利用ara-pbad启动子调控leuo n端结构域的表达，使其表达量达到激活解除h-ns对pcas启动子的抑制，级联调控gfp报告基因表达，利用leuo n端结构域的渗漏表达不足以解除h-ns对pcas启动子的抑制的特点，实现pcas启动子诱导下游基因表达的绝对严谨。
13、本专利技术尝试利用自然条件下h-ns/leuo对于pcas序列的竞争结合关系构建pcas表达调控系统，用于绝对严谨调控路线的构建，以有助于滴度控制目的基因的表达，如毒素蛋白等。利用严谨诱导型pcas启动子构建的表达调控系统比现有最严谨的ara-pbad启动子的渗漏还低10倍，为基因表达与代谢通路调控等研究和应用提供了高效表达元件，可以促进代谢工程、系统生物学及合成生物学的发展。
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1.一种利用严谨诱导型Pcas启动子构建表达调控系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种利用严谨诱导型Pcas启动子构建表达调控系统的方法，其特征在于，在所述步骤S1中：利用λred系统同源重组的方法替换和敲除菌株中casA基因的Pcas启动子序列和araBAD操纵子序列。
3.根据权利要求2所述的一种利用严谨诱导型Pcas启动子构建表达调控系统的方法，其特征在于，在所述步骤S2中：将待表达基因替换gfp报告基因，插入已构建好的报告质粒进行表达。
4.根据权利要求3所述的一种利用严谨诱导型Pcas启动子构建表达调控系统的方法，其特征在于，在所述步骤S2中：所述Pcas启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，leuO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，ara-PBAD启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，ara-PBAD启动子的阻遏蛋白araC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，gfp报告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
5.根据权利要求4所述的
...【技术特征摘要】
1.一种利用严谨诱导型pcas启动子构建表达调控系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种利用严谨诱导型pcas启动子构建表达调控系统的方法，其特征在于，在所述步骤s1中：利用λred系统同源重组的方法替换和敲除菌株中casa基因的pcas启动子序列和arabad操纵子序列。
3.根据权利要求2所述的一种利用严谨诱导型pcas启动子构建表达调控系统的方法，其特征在于，在所述步骤s2中：将待表达基因替换gfp报告基因，插入已构建好的报告质粒进行表达。
4.根据权利要求3所述的一种利用严谨诱导型pcas启动子构建表达调控系统的方法，其特征在于，在...
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