一种快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法技术

本发明专利技术公开一种快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法，向待测样品中加入免疫化超顺磁纳米粒子，使免疫化超顺磁纳米粒子与阪崎肠杆菌发生特异性结合；收集免疫化超顺磁纳米粒子，洗涤后加入免疫化荧光量子点，使之与载于免疫化超顺磁纳米粒子的阪崎肠杆菌发生特异性结合；再利用外加磁场作用吸附收集载于免疫化超顺磁纳米粒子的阪崎肠杆菌与免疫化荧光量子点结合物，洗涤后定性或定量荧光检测。本方法能从各种样本中迅速分离目标菌，同时加以高效富集，操作方便、简单，可靠性好，对配套设备要求低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物检测领域，公开了一种利用免疫化的超顺磁纳米粒子和免疫化 的荧光量子点快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法。
技术介绍
食源性致病菌快速检测一直是研究关注的焦点，《中华人民共和国食品安全法》于 2009年2月28日在第十一届全国人民代表大会常务委员会第七次会议通过。食源性致病 菌快速检测是采用微生物学、化学、生物化学、生物物理、免疫学的方法对食品及其加工、贮 藏等环境中的致病菌进行分离、检测、鉴定和计数。现在广泛使用的检测方法主要有三种平皿培养分离计数法，聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR)与焚光 PCR 检验方法。阪崎肠杆菌(又称阪崎氏肠杆菌)是肠杆菌科的一种，1980年由黄色阴沟肠杆菌 更名为阪崎肠杆菌。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和茵血症，死亡率 高达50%以上。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来源，但许多病例报告表明婴 儿配方粉是目前发现的主要感染渠道。阪崎肠杆茵的生物学性状及其对人群的健康危害受 到人们的关注并被报告。阪崎肠杆菌是奶粉(乳)制品中新发现的一种致病菌。由其引发的婴儿、早产儿脑 膜炎、败血症及坏死性结肠炎散发和暴发的病例已在全球相继出现。多份研究报告表明婴 儿配方奶粉是当前发现致婴儿、早产儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎的主要感染渠道，在 某些情况下，由阪崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率可达40% 80%。阪崎肠杆菌已引起 世界多国相关部门的重视。据报道，国外乳业巨头曾因此被召回。在美国FDA2002年在本 土某一些国际乳业巨头生产的婴儿配方奶粉中检出阪崎肠杆菌后，2003年又一家国际乳业 巨头公司主动召回在美国生产的一批检出极微量阪崎肠杆菌的罐装早产儿特殊配方奶粉， 阪崎肠杆菌从此成为世界瞩目的焦点。但是国内企业鲜有自查能力，原因是国内以前还没 有专门的检测手段，而去买一套以前国内从未有过的检测设备也不是马上就可办到的。传统的平皿培养分离鉴定法是应用微生物检验的增菌培养、分离、生化鉴定等方 法对奶粉中可能存在的食源性致病菌进行定性和定量的检验。其特点是稳定可靠，是目前 最成熟，使用最广泛，作为基准的检验方法，但是存在检测时间长，过程繁琐，对操作人员技 术要求高以及对特定血清型难以分离鉴定的问题。PCR聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种分子生物学技术， 用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。样品(经前处理增菌后)，采 用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，以提取的DNA为模版进行PCR扩增。通过琼脂糖凝 胶电泳检验PCR产物是否有特征条带，从而对样品中是否污染食源性致病菌进行快速检验 用PCR技术检测有害微生物具有特异性强、灵敏度高和操作简便、省时等优点。荧光PCR在 普通PCR基础上加入一条特异的寡核苷酸荧光探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监 控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品的初始模版，可以通过测定放射性强度考查样品中微生物数量。但是PCR反应受样品情况的影响比较大，特别在食 源性有害微生物检查中，食品中的成分(糖类、酸类，油脂等物质)会干扰反应的正常进行。 而检测的环境，中间处理环节也会带来一些PCR反应抑制剂。从而使PCR反应呈现较高的 假阳性和假阴性率。为了对我国食品安全作出贡献，丰富致病菌检测方法，提高对食源性致病菌的检 测速度，为可能出现的食品安全问题提供应对方法，需要对现有技术做出改进，研发了“磁 性分离荧光标记定性定量检测乳粉中阪崎肠杆菌”方法。
技术实现思路
本专利技术旨在提供。一种快速测筛选阪崎肠杆菌的方法，步骤包括(1)向待测样品中加入免疫化超顺磁纳米粒子，15 35V混合反应10 60min， 使免疫化超顺磁纳米粒子与阪崎肠杆菌发生特异性结合；(2)在外加磁场吸引作用下，收集免疫化的超顺磁纳米粒子，洗涤后加入免疫化荧 光量子点，15 35°C混合反应10 60min，使之与载于免疫化超顺磁纳米粒子的致病微生 物阪崎肠杆菌发生特异性结合；(3)利用外加磁场吸引作用下收集载于免疫化超顺磁纳米粒子的阪崎肠杆菌与免 疫化荧光量子点结合物，洗涤后定性或定量荧光检测；所述免疫化超顺磁纳米粒子为以四氧化三铁纳米粒子为内核，以二氧化硅为外 壳，表面偶联特异性抗体的磁性粒子；所述的特异性抗体为抗阪崎肠杆菌多克隆抗体或抗 阪崎肠杆菌单克隆抗体；所述的免疫化荧光量子点为与联特异性抗体连接的量子点，所述的特异性抗体为 抗阪崎肠杆菌多克隆抗体或抗阪崎肠杆菌单克隆抗体。步骤(2)和(3)所述的外加磁场为2000 6500Gs。所述免疫化超顺磁纳米粒子的制备方法包括(i)将包裹二氧化硅的四氧化三铁磁性纳米粒子与N-(2_氨基乙基)_3_氨基丙基 三甲基硅烷反应，得到表面氨基化的磁性纳米粒子；N-(2-氨基乙基)-3_氨基丙基三甲基 硅烷与包裹二氧化硅的四氧化三铁纳米粒子比例0. 05 0. lml/g，所述的包裹二氧化硅的 四氧化三铁磁性纳米粒子粒径为50nm 150nm ；可通过现有技术制备包裹二氧化硅的四氧化三铁磁性纳米粒子，例如，制备 Y "Fe203磁核，再通过反相微乳液法对磁核、"Fe203进行包裹并煅烧。(ii)将表面氨基化的磁性纳米粒子分散于pH 7. 25 7. 5、并且戊二醛质量浓度 为 2%的磷酸缓冲液中，将特异性抗体与步骤(i)所得表面氨基化的磁性纳米粒子偶 联，得到免疫化的磁性纳米粒子；所述的特异性抗体为抗阪崎肠杆菌多克隆抗体或抗阪崎 肠杆菌单克隆抗体。所述的表面氨基化的磁性纳米粒子与抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的重量比为 1 (0. 004 0. 04)；所述的表面氨基化的磁性纳米粒子与抗阪崎肠杆菌单克隆抗体的重量比为 1 (0. 001 0. 02)。所述免疫化荧光量子点的制备方法包括如下步骤(A)将pH 7. 25 7. 5、含有交联剂的磷酸缓冲液的与表面修饰有羧基的量子点混 合，反应5 20min以活化羧基；交联剂优选为1_ (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺 盐酸盐，浓度为10mg/ml至50mg/ml ；(B)加入保护剂反应20 60min ；保护剂优选为N_羟基硫代琥珀酰亚胺；(C)加入特异性抗体混合，反应0. 5 4hr，除去未反应的特异性抗体，收集免疫化 荧光量子点；所述的特异性抗体为抗阪崎肠杆菌多克隆抗体或抗阪崎肠杆菌单克隆抗体；所述抗阪崎肠杆菌多克隆抗体与量子点的比例为1 (4X 105 4X 106)mmoml/ mg ；所述抗阪崎肠杆菌单克隆抗体与量子点的比例为1 (1X105 2X106)mmoml/ mg。量子点，又可称为纳米晶，是一种由II-VI族或III-V族元素组成的纳米颗粒。量 子点的粒径一般介于1 lOnm之间，由于电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成具 有分子特性的分立能级结构，受激后可以发射荧光。基于量子效应，量子点在太阳能电池， 发光器件，光学生物标记等领域具有广泛的应用前景。其具有传统荧光染料和镧系配合物 无法比拟的荧光特性更宽的激发光谱、更窄的发射光谱、更长的寿命等。本方法首先制备具有超顺磁性的四氧化三铁纳米粒子，在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测筛选阪崎肠杆菌的方法，其特征在于，步骤包括：（１）向待测样品中加入免疫化超顺磁纳米粒子，１５～３５℃混合反应１０～６０ｍｉｎ，使免疫化超顺磁纳米粒子与阪崎肠杆菌发生特异性结合；（２）在外加磁场吸引作用下，收集免疫化超顺磁纳米粒子，洗涤后加入免疫化荧光量子点，１５～３５℃混合反应１０～６０ｍｉｎ，使之与载于免疫化超顺磁纳米粒子的阪崎肠杆菌发生特异性结合；（３）利用外加磁场作用吸附收集载于免疫化超顺磁纳米粒子的阪崎肠杆菌与免疫化荧光量子点结合物，洗涤后定性或定量荧光检测；所述免疫化超顺磁纳米粒子为以四氧化三铁纳米粒子为内核，以二氧化硅为外壳，表面偶联特异性抗体的磁性粒子；所述的特异性抗体为抗阪崎肠杆菌多克隆抗体或抗阪崎肠杆菌单克隆抗体；所述的免疫化荧光量子点为与联特异性抗体连接的量子点，所述的特异性抗体为抗阪崎肠杆菌多克隆抗体或抗阪崎肠杆菌单克隆抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：支援，孟谨，顾鸣，韩奕奕，沈鹤柏，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]