本发明专利技术属于核酸检测技术领域，具体公开了一种开关式核酸适体探针及其应用，该核酸适体探针包括探针本体和分别连接于该探针本体两端的荧光发生单元和荧光熄灭单元，探针本体包含有对目标肿瘤细胞具有特异性识别功能的核酸适体片段和与该核酸适体片段形成互补序列的核酸片段，核酸适体片段和核酸片段通过一７～１５ｎｍ长的连接片段连接形成一发夹型结构；核酸片段竞争性杂交核酸适体片段的能力弱于目标肿瘤细胞。本发明专利技术探针的应用可以是对缓冲液中肿瘤活细胞的特异性检测、对血清中肿瘤活细胞的有效检测及活动物体内肿瘤的实时荧光成像和活体检测中的至少一种。本发明专利技术的探针具有较高稳定性、特异性和灵敏性，其应用操作简单、快速、灵敏、特异、成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于核酸检测
，尤其涉及一种核酸适体探针及其在肿瘤检测中的应用。
技术介绍
肿瘤是威胁人类健康的常见疾病。对肿瘤细胞进行准确的免疫分型有利于实现肿 瘤的早期诊断和治疗，从而提高肿瘤治愈率。抗原-抗体反应是免疫学诊断的基础，过去几 十年间抗体技术的迅速发展对肿瘤诊断及治疗相关研究做出了巨大贡献，然而近年来核酸 适体的出现却使得抗体技术受到前所未有的挑战。核酸适体(又称Aptamer)是利用核苷酸之间严格的识别能力和亲和力而设计的 人工合成寡核苷酸，并通过指数富集配体的系统进化(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment, SELEX)技术筛选而获得。核酸适体不仅具有类似抗体对靶标 高特异性和高亲和力的特点，更在许多方面优于抗体，如分子量小、无免疫原性、靶标种类 丰富(包括酶、生长因子、抗原、基因调节因子、细胞黏附分子、完整的肿瘤细胞等)、合成方 法简单且重复性好、修饰灵活以及便于长期贮存和常温运输等等。这些特性使得核酸适体 作为肿瘤诊断探针得到了广泛的关注和认可，而基于核酸适体的肿瘤识别与检测方法正逐 渐成为一种新的、普遍适用的技术，为肿瘤细胞分型、诊断和治疗相关领域的发展带来了新 的契机。"Aptamers Evolved from Live Cells as Effective Molecular Probes for Cancer Study. ”《Proc. Natl. Acad. Sci. USA》2006，103(32) 11838-11843 ；Dihua Shangguan, Ying Li，Zhiwen Tang, et al.发展了一种以全细胞为靶标的 cell-SELEX 技 术，针对白血病细胞筛选出一组特异性核酸适体，并利用荧光染料标记的核酸适体成功实 现了对正常人骨髓抽吸混合细胞中目标白血病细胞的有效识别与检测。随后，该研究小组 又采用cell-SELEX技术筛选出分别针对淋巴瘤、肝癌、肺癌等多种肿瘤细胞的一系列核酸 适体，并将其广泛应用于多种肿瘤细胞或组织的分型与检测中。然而，目前基于核酸适体建 立的肿瘤检测方法，还主要是采用单一的信号标记手段如荧光或放射性标记，仅仅将核酸 适体作为靶向分子，利用其与目标和非目标细胞之间的亲和力差异来实现对肿瘤细胞的识 另O。由于核酸适体与非目标细胞之间必然存在一定的非特异性吸附，这类方法无法满足对 复杂混合体系中肿瘤细胞的便捷、快速、高特异和高灵敏的分析要求，限制了临床检测中肿 瘤早期诊断的实现和相关治疗的开展。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有较高稳定性、特 异性、灵敏性的开关式核酸适体探针，还提供一种操作简单、快速、灵敏、特异、成本低的开 关式核酸适体探针在肿瘤活细胞及活体检测中的应用方法。为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为一种开关式核酸适体探针，该核 酸适体探针包括探针本体和分别连接于该探针本体两端的荧光发生单元和荧光熄灭单元， 所述探针本体包含有对目标肿瘤细胞具有特异性识别功能的核酸适体片段(设为片段1) 和与该核酸适体片段形成6 12对碱基互补序列(连续的)的核酸片段(设为片段2)，所 述核酸适体片段和核酸片段通过一 7 15nm长的连接片段(设为片段3)连接形成一发夹 型结构；所述核酸片段竞争性杂交所述核酸适体片段的能力弱于所述目标肿瘤细胞杂交核 酸适体片段的能力。该技术方案中，所述片段1具有对目标肿瘤细胞的特异性识别能力；所 述片段2由于与片段1形成6-12对碱基互补序列，因此片段2的主要作用是与片段1的部 分序列杂交以形成稳定的发夹构型，同时其杂交能力不会影响目标肿瘤细胞对片段1的竞 争性结合；所述片段3的主要作用是将片段1和片段2连接成一条探针本体。所述片段2 应当是与片段1靠近端部荧光发生(或熄灭)单元处的序列互补，以使得探针两端的荧光 发生单元和荧光熄灭单元能尽可能靠近。上述的开关式核酸适体探针中，所述荧光发生单元优选为荧光染料分子或荧光纳 米颗粒；所述荧光熄灭单元优选为荧光熄灭基团或者为具有荧光淬灭效果的功能化纳米材 料。上述的开关式核酸适体探针中，所述荧光染料分子优选为荧光素、罗丹明或Cy5; 所述荧光纳米颗粒优选为包裹荧光染料的二氧化硅纳米颗粒或荧光量子点。所述荧光熄灭 基团优选为DABCYL、BHQ1或BHQ2 ；所述具有荧光淬灭效果的功能化纳米材料优选为金纳米 颗粒或碳纳米管。本领域人员可以自行确定和选择荧光发生单元和荧光熄灭单元的实施组 合方式，例如荧光素与DABCYL、荧光素与BHQ1、四甲基罗丹明与BHQ2、四甲基罗丹明与金纳 米颗粒、Cy5与金纳米颗粒、Cy5与碳纳米管、包裹荧光染料的二氧化硅纳米颗粒与BHQ2、荧 光量子点与BHQ2等等。上述的开关式核酸适体探针中，所述核酸适体片段优选是指通过指数富集的配体 系统进化技术(简称SELEX技术)筛选出来的肿瘤细胞特异性核酸适体。更优选的，所述 核酸适体片段是指对人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(简称CCRF-CEM肿瘤细胞)具有 特异性识别能力的核酸适体序列1或者对人B淋巴细胞瘤细胞(简称Ramos细胞)具有特 异性识别能力的核酸适体序列2或者对小鼠肝细胞瘤细胞(简称MEAR细胞)具有特异性 识别能力的核酸适体序列3 ；其中，所述核酸适体序列1的核苷酸序列为5' -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3'；所述核酸适体序列2的核苷酸序列为5，-MC ACC GTG GAG GAT AGT TCG GTG GCT GTT CAG GGT CTC CTC CCG GTG-3 ‘；所述核酸适体序列3的核苷酸序列为5' -AGT CCA TTT TAT TCC TGA ATA TTT GTT AAC CTC ATG GAC-3‘。上述的开关式核酸适体探针中，所述连接片段优选为一段不会与所述核酸适体片 段和核酸片段杂交的片段，或者为一段具有亲水性和生物相容性的聚合物链(如聚乙二醇寸J ο作为一个总的技术构思，本专利技术还提供一种上述的开关式核酸适体探针在肿瘤活 细胞及活体检测中的应用，所述应用包括以下三种检测中的至少一种(1)对缓冲液中肿瘤活细胞的特异性检测；(2)对血清中肿瘤活细胞的有效检测；(3)活动物体内肿瘤的实时荧光成像和活体检测。上述的应用中，所述对缓冲液中肿瘤活细胞的特异性检测的具体检测步骤优选为在待测缓冲液中加入所述开关式核酸适体探针5 50nM，于常温下避光培育15min后， 立即采用流式细胞仪检测细胞的荧光信号，并对收集到的细胞群(例如可以10000个计为 一群)的荧光强度进行统计分析，当荧光强度高于10的特定细胞数占细胞群中细胞总数的 20%以上时，即认为待测缓冲液中有目标肿瘤活细胞被所述开关式核酸适体探针检出。上述的应用中，所述对血清中肿瘤活细胞的有效检测的具体检测步骤优选为在 待测血清中加入所述开关式核酸适体探针5 50nM，于冰上避光培育30min后，立即采用流 式细胞仪检测细胞的荧光信号，并对收集到的细胞群(例如可以10000个计本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种开关式核酸适体探针，其特征在于：该核酸适体探针包括探针本体和分别连接于该探针本体两端的荧光发生单元和荧光熄灭单元，所述探针本体包含有对目标肿瘤细胞具有特异性识别功能的核酸适体片段和与该核酸适体片段形成６～１２对碱基互补序列的核酸片段，所述核酸适体片段和核酸片段通过一７～１５ｎｍ长的连接片段连接形成一发夹型结构；所述核酸片段竞争性杂交所述核酸适体片段的能力弱于所述目标肿瘤细胞杂交核酸适体片段的能力。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王柯敏，石慧，何晓晓，叶晓生，伍旭，郭秋平，周冰，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]
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