甲基杆菌亚砜合成酶制造技术

本发明专利技术公开了甲基杆菌亚砜合成酶

【技术实现步骤摘要】
甲基杆菌亚砜合成酶MpEgtB突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及甲基杆菌亚砜合成酶
MpEgtB
突变体及其应用，属于生物工程

。

技术介绍

[0002]麦角硫因
(L
‑
ergothioneine,L
‑
EGT)
是一种组氨酸衍生的硫醇化合物，一个多世纪前从麦角真菌
(Claviceps purpurea)
中分离获得
。
因为具有特殊的硫酮结构和较高的氧化还原电势，
EGT
在生理
pH
条件下不易发生自氧化，具有比谷胱甘肽更高的稳定性和抗氧化活性，可参与维持机体细胞内的氧化还原态
、
调节能量
、
预防癌症和心血管疾病等
。
然而，研究表明人体自身不能合成麦角硫因，只能从蘑菇和红豆等饮食中摄取
。
目前，对
EGT
作为膳食补充剂和化妆品添加剂的市场需求日益旺盛，天然来源的
EGT
无法满足需求
。
[0003]EGT
的制备方法主要包括天然生物提取法
、
化学合成法和生物合成法，其中提取法来源受限，难以实现大规模工业化生产；化学合成法难度大，产品安全性难以保证；生物法具有安全环保
、
产量易扩大
、
生产可持续性等优点，是
EGT
制备的主要发展方向
。
现已报道了
EGT
的好氧生物合成途径和厌氧生物合成途径，主要包括
EGT
在以分枝杆菌
(mycobacteria)
为代表的原核生物中的合成途径
、
以粗糙脉孢菌
(Neurospora crassa)
为代表的真核生物中的合成途径，以及以泥生绿菌
(Chlorobium limicola)
为代表的厌氧菌生物合成途径
。
以这些合成途径为指导，利用未经基因工程改造的天然可食用蕈菌，如金针菇
(Flammulina velutipes)、
平菇
(Pleurotus ostreatus)
和香菇
(Lentinus edodes)
等发酵制备
EGT
，通过建立积累
EGT
的深层发酵控制策略，摇瓶发酵液中
EGT
的积累量超过
500mg/L(
梅保良等
,2015)
；通过麦角硫因生物合成酶的异源表达，构建
EGT
生产的工程菌，通过前体氨基氨酸的合成途径改造与优化等策略进一步提高
EGT
合成效率
。
专利
(CN 113234652 A)
公开了将
EGT
合成基因
egtBCDE
与异源的麦角硫因合成途径酶
egt1
组合，同时表达大肠杆菌基因
gshA
的同工酶
egtA
，获得工程菌
E1 A1
的
EGT
产量为
125.8mg/L
；进一步对工程菌
E1 A1
的组氨酸
、
甲硫氨酸
、
半胱氨酸代谢改造，获得工程菌的
EGT
产量提高到
244.97mg/L
，在
3L
发酵罐分批补料发酵
108h
，获得的
EGT
产量为
1102.96mg/L。
[0004]然而，目前关于
EGT
合成途径关键酶的改造方面的研究报道并不多见，
Osawa R
等
(J Agric Food Chem.2018Feb 7
；
66(5):1191
‑
1196)
提出原核生物耻垢分枝杆菌
(Mycobacterium smegmatis)EgtB
酶是合成
EGT
的限速酶
。
对包括
EgtB
酶在内的麦角硫因合成途径上的关键酶进行改造，提高酶的催化性能，有望提升
EGT
的生物合成水平，为生物酶法合成
EGT
的工业化应用提供参考
。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种可以高效制备
L
‑
EGT
的甲基杆菌
(Methylobacterium pseudosasicola)
来源的亚砜合成酶
MpEgtB
突变体及其改造方法，并利用该突变体蛋白催化组氨酸三甲基内盐
(HER)
，以
L
‑
Cys
为硫供体直接转化为组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚
砜
(Cys
‑
HER)
，以及进一步将得到的突变体与耻垢分枝杆菌
(Mycobacterium smegmatis)
来源的
SAM(S
‑
腺苷蛋氨酸
)
依赖型组氨酸甲基转移酶
MsEgtD、PLP
结合型
C
‑
S
裂解酶
MsEgtE
偶联，以
L
‑
His
和
L
‑
Met
为底物制备
L
‑
EGT。
[0006]本专利技术提供了一种
M.pseudosasicola
来源的亚砜合成酶
MpEgtB
突变体，所述突变体为，以氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示的亚砜合成酶
MpEgtB
为出发序列，对第
106、173
和
409
位氨基酸中的一个或多个进行突变得到的
。
[0007]在本专利技术的一种实施方式中，编码所述亚砜合成酶
MpEgtB
亲本酶的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体相对于
MpEgtB
亲本，将其第
106
位酪氨酸突变为苯丙氨酸，获得突变体
MpEgtB
Y106F
。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体相对于
MpEgtB
亲本，将其第
173
位亮氨酸突变为苏氨酸，获得突变体
MpEgtB
L173T
。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
甲基杆菌亚砜合成酶
MpEgtB
突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示的甲基杆菌亚砜合成酶的第
106
位
、
第
173
位和第
409
位中的一个或多个氨基酸进行突变
。2.
根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体为
(a)
～
(f)
任一：
(a)
将氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示的甲基杆菌亚砜合成酶
MpEgtB
的第
106
位的酪氨酸突变为苯丙氨酸；
(b)
将氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示的甲基杆菌亚砜合成酶
MpEgtB
的第
173
位的亮氨酸突变为苏氨酸；
(c)
将氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示的甲基杆菌亚砜合成酶
MpEgtB
的第
409
位的谷氨酰胺突变为精氨酸；
(d)
将氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示的甲基杆菌亚砜合成酶
MpEgtB
的第
106
位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，同时将第
173
位的亮氨酸突变为苏氨酸；
(e)
将氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示的甲基杆菌亚砜合成酶
MpEgtB
的第
106
位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，同时将第
409
位的谷氨酰胺突变为精氨酸；
(f)
将氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示的甲基杆菌亚砜合成酶
MpEgtB
的第
106
位酪氨酸突变为苯丙氨酸，并将第
173
位亮氨酸突变为苏氨酸，同时将第
409
位谷氨酰胺突变为精氨酸
。3.
编码权利要求1或2所述甲基杆菌亚砜合成酶
MpEgtB
突变体的基因
。4.
携带权利要求3所述基因的重组载体
。5.
根据权利要求4所述的重组载...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴静，武耀运，刘立明，宋伟，刘佳，魏婉清，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：