快速鉴定假禾谷镰孢菌对制造技术

本发明专利技术公开了假禾谷镰孢菌琥珀酸脱氢酶

【技术实现步骤摘要】
快速鉴定假禾谷镰孢菌对Cyclobutrifluram和氟唑菌酰羟胺抗药性的方法


[0001]本专利技术属于分子生物学

。
涉及一种假禾谷镰孢菌琥珀酸脱氢酶
B(FpSdhB)
和
C1(FpSdhC1)
蛋白相关基因
FpSdh B
和
FpSdh C1上核苷酸点突变的鉴定及其在杀菌剂
Cyclobutrifluram
和氟唑菌酰羟胺抗性检测中的应用，具体涉及一种快速鉴定假禾谷镰孢菌
FpSdh B
和
FpSdh C1基因核苷酸点突变及其对
Cyclobutrifluram
和氟唑菌酰羟胺抗药性的分子检测方法及专用引物
。

技术介绍

[0002]小麦茎基腐病在我国发生日趋严重，威胁我国粮食安全的同时也存在真菌毒素污染的潜在风险
。
该病害是由多种病原菌引起的土传病害，其优势致病菌是假禾谷镰孢菌
(Fusarium pseudograminearum)。
遗憾的是，目前我国尚未有登记的化学药剂用于该病害的防治
。
由先正达公司研发的两种新型琥珀酸脱氢酶抑制剂
Cyclobutrifluram
和氟唑菌酰羟胺在室内和田间对
F.pseudograminearum
均表现出优异的抑制活性
。
[0003]当前杀菌剂抗性行动委员会
(Fungicide Resistance Raction Committee
，
FRAC)
将其抗药性风险定为中等到高等，需要进行抗性的风险管理
。
本研究室通过药剂驯化的方法得到了对
Cyclobutrifluram
和氟唑菌酰羟胺产生高水平抗性的假禾谷镰孢菌菌株，并且有一些高水平抗性菌株的生存适合度较高
。
但是假禾谷镰孢菌引起的小麦茎基腐病属于土传病害，在该病害的防控过程中这两种杀菌剂常用于种子处理
。
推测假禾谷镰孢菌对
Cyclobutrifluram
和氟唑菌酰羟胺具有中等抗性风险
。
因此，未来在使用
Cyclobutrifluram
和氟唑菌酰羟胺防治植物病原真菌病害时，需要加强抗性监测，并对这两种
SDHIs
杀菌剂的抗性发生情况进行及时的预警，从而指导
Cyclobutrifluram
和氟唑菌酰羟胺的科学使用，延缓其抗药性的产生，延长药剂的使用年限
。
[0004]杀菌剂抗性常规检测方法包括：菌丝生长速率法
、
菌丝干重测定法
、
孢子萌发测定法和琼脂展布法等
。
但是这些方法都需要先分离并纯化获得病原菌，然后将病原菌接种到带药培养基上或者接种于杀菌剂处理过的活体植株或组织上，一定时间之后才能调查结果
。
采用常规的方法，当田间抗药性菌株的频率大于1％时，才能被检测的到
(
如有
95
％的概率检测到1％频率的抗药性菌株，检测的样本量需要大于
300)
，因此具有灵敏度低，工作量大，试验周期长等缺点
。
[0005]随着分子生物学技术的飞速发展及其应用范围的不断扩展，限制性酶切
PCR
和等位特异
PCR
分子技术开始在病原菌抗药性检测中应用
。
与传统的检测方法比较，不但节省了检测时间提高了工作效率，而且增强了检测的灵敏度，检测频率在
10
‑5～
10
‑4，更适用于检测低频率的抗药性基因，也被作为田间抗药性早期诊断的理想方法
。
因此，分子检测技术将在病害的可持续管理系统中发挥愈来愈重要的作用
。

技术实现思路

[0006]为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种假禾谷镰孢菌对
Cyclobutrifluram
和氟唑菌酰羟胺抗性相关蛋白及其编码基因，以及其作为假禾谷镰孢菌对这两种杀菌剂抗性筛选标记，在进行假禾谷镰孢菌对
Cyclobutrifluram
和氟唑菌酰羟胺抗性鉴定中的应用
。
[0007]为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：
[0008]本专利技术的一个目的是提供假禾谷镰孢菌
Cyclobutrifluram
和氟唑菌酰羟胺抗性相关蛋白，是如下
1))
‑
4)
中任意一项所示的蛋白质：
[0009]1)
由序列表中的
SEQ ID NO:20/SEQ ID NO:21
的氨基酸残基序列组成的
Cyclobutrifluram
抗性相关蛋白质；
[0010]2)
将序列表中的
SEQ ID NO:20/SEQ ID NO:21
的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和
/
或缺失和
/
或添加且与
Cyclobutrifluram
抗性功能相关的由
SEQ ID NO:20/SEQ ID NO:21
衍生的蛋白质；
[0011]3)
由序列表中的
SEQ ID NO:21
的氨基酸残基序列组成的与
Cyclobutrifluram
和
/
或氟唑菌酰羟胺抗性相关蛋白质；
[0012]4)
将序列表中的
SEQ ID NO:21
的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和
/
或缺失和
/
或添加且与
Cyclobutrifluram
和
/
或氟唑菌酰羟胺抗性功能相关的由
SEQ ID NO:21
衍生的蛋白质
。
[0013]其中，所述假禾谷镰孢菌
Cyclobutrifluram
抗性相关蛋白，为
FpSdhB
蛋白，自
N
端第
248
位氨基酸为组氨酸时，对
Cyclobutrifluram
敏感型基因型，自
N
端起第
248
位氨基酸突变为酪氨酸时，假禾谷镰孢菌对
Cyclobutrifluram
表现抗药性
。FpSdhC1蛋白自氨基端第
83
位氨基酸为丙氨酸且自氨基端第
86
为精氨酸时，对
Cyclobutrifluram
和氟唑菌酰羟胺敏感型基因型，自
N
端起第
83
位氨基酸突变为缬氨酸或
86
位氨基酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
假禾谷镰孢菌对
Cyclobutrifluram
和
/
或氟唑菌酰羟胺抗性相关蛋白，是如下
1)
‑
4)
中任意一项所示的蛋白质：
1)
由序列表中的
SEQ ID NO:20
的氨基酸残基序列组成的
Cyclobutrifluram
抗性相关蛋白质；
2)
将序列表中的
SEQ ID NO:20
的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和
/
或缺失和
/
或添加且与
Cyclobutrifluram
抗性功能相关的由
SEQ ID NO:20
衍生的蛋白质；
3)
由序列表中的
SEQ ID NO:21
的氨基酸残基序列组成的与
Cyclobutrifluram
和氟唑菌酰羟胺抗性相关蛋白质；
4)
将序列表中的
SEQ ID NO:21
的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和
/
或缺失和
/
或添加且与
Cyclobutrifluram
和氟唑菌酰羟胺抗性功能相关的由
SEQ ID NO:21
衍生的蛋白质；
SEQ ID NO:20
中，自氨基端第
248
位氨基酸
X
为
H
或
Y
；
SEQ ID NO:21
中，自氨基端第
83
位氨基酸
X
为
A
或
V
，自氨基端第
86
位氨基酸
X
为
R
或
K。2.
权利要求1所述的假禾谷镰孢菌对
Cyclobutrifluram
或氟唑菌酰羟胺抗性相关蛋白的编码基因
。3.
根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的
DNA
核苷酸序列如下
1)、2)
或
3)
所示：
1)
序列表中
SEQ ID NO:22
或
SEQ ID NO:23
的核苷酸序列；
2)
在严格条件下可与
1)
所述的
DNA
序列重组且编码
Cyclobutrifluram
和
/
或氟唑菌酰羟胺抗性功能相关蛋白的
DNA
分子；
3)
与序列表中
SEQ ID NO:22
或
SEQ ID NO:23
的核苷酸序列具有
90
％以上的同源性的且编码与
Cyclobutrifluram
或氟唑菌酰羟胺抗性功能相关蛋白的
DNA
分子；
SEQ ID NO:22
中，自
5'
端起第
869
位核苷酸
y
＝
c
或
t
；
SEQ ID NO:23
中，自
5'
端起第
346
位核苷酸
y
＝
c
或
t,
自
5'
端起第
355
位核苷酸
r
＝
g
或
a。4.
含有权利要求2或3所述的编码基因的表达盒
、
重组表达载体或转基因重组菌
。5.
假禾谷镰孢菌
FpSdhB
和
FpSdhC1蛋白或其编码基因在鉴定假禾谷镰孢菌抗药性中的应用
。6.
根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过检测假禾谷镰孢菌
FpSdhB
蛋白自
N
端起第
248
位氨基酸是否由组氨酸变为酪氨酸，如果第
248
位氨基酸由组氨酸变为酪氨酸，则其对
Cyclobutrifluram
的抗性提高；以及通过检测假禾谷镰孢菌
FpSdhC1蛋白自
N
端起第
83
位氨基酸是否由丙氨酸变为缬氨酸，或第
86
位氨基酸是否由精氨酸变为赖氨酸，如果自
N
端起第
83
位氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸或
86
位氨基酸由精氨酸变为赖氨酸，则其对
Cyclobutrifluram
和氟唑菌酰羟胺抗性提高；其中，假禾谷镰孢菌
FpSdhB
蛋白为权利要求1中第
1)
或
2)
项所述的蛋白质；假禾谷镰孢菌
FpSdhC1蛋白为权利要求1中第
3)
或
4)
项所述的蛋白质；优选的，通过检测假禾谷镰孢菌
FpSdhB
蛋白的编码基因自
5'
端起第
869
位核苷酸为
T
，如果第
869
位为
T
，则其对
Cyclobutrifluram
的抗性提高；通过检测假禾谷镰孢菌
FpSdhC1蛋白的编码基因自
5'
端起第
346
位核苷酸为
T
或
355
位核苷酸为
A
，如果第
346
位核苷酸为
T
或
355
位核苷酸为
A
，则其对
Cyclobutrifluram
和氟唑菌酰羟胺的抗性提高；假禾谷镰孢菌
FpSdhB
和
FpSdhC1蛋白的编码基因为权利要求2或3所示的编码基因
。7.
一种检测或辅助检测假禾谷镰孢菌中是否存在突变位点的引物组，为如下
1)
‑
3)
中任意一项所述的引物组：
1)
检测或辅助检测假禾谷镰孢菌中
FpSdh B
基因是否存在突变位点的引物组，由序列表中
SEQ ID NO:5
所示的
DNA
分子和
SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘西莉，李怡文，苗建强，高续恒，代探，唐义冬，李桂香，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：