一种可容纳非天然金属卟啉的细胞色素突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种可容纳非天然金属卟啉的细胞色素突变体

【技术实现步骤摘要】
一种可容纳非天然金属卟啉的细胞色素突变体、人工金属酶及应用


[0001]本专利技术涉及生物催化酶领域，特别是涉及一种可容纳非天然金属卟啉的细胞色素突变体
、
人工金属酶及应用
。

技术介绍

[0002]金属酶是自然界中强大的催化剂，天然金属酶中的辅因子通常是含有金属的卟啉化合物，目前天然酶使用的金属元素仅限于铁
、
铜
、
锌
、
钴等少数几种，而且配体的类型有限
。
随着金属有机催化技术的发展，许多过渡金属，特别是贵金属，被认为具有良好的催化活性
。
将这类金属配合物作为辅因子与蛋白质结合，可以构建人工酶，催化新的反应
。
[0003]硫氧化反应产物为亚砜，亚砜的过度氧化会生成产物砜
。
其中亚砜产物因在药物设计中具有多种生物活性而广受关注
。
一些
Baeyer
‑
Villiger
单加氧酶被开发用于硫醚的氧化反应，如不动杆菌中环己酮单加氧酶
(CHMO)、
苯丙酮单加氧酶
(PAMO)、
荧光假单胞菌的4‑
羟基苯乙酮单加氧酶
(HAPMO)
被成功用于各种烷基和芳基硫醚氧化得到亚砜或砜
。
但是，这些天然的
Baeyer
‑
Villiger
单加氧酶不能催化空间上体积大的硫醚的氧化
。
近几年许建和教授团队通过基因挖掘先后发现了可以催化硫醚氧化的天然的
Baeyer
‑
Villiger
单加氧酶，源自慢生根瘤菌的
BoBVMO
和源自海气微菌的
AmBVMO
，对奥美拉唑
(Omeprazole)
等大体积底物具有一定反应性；而来自巴塞尔贪铜菌的
CbBVMO
对兰索拉唑
(Lansoprazole)
具有
99
％的对映选择性，但转化率较低
(20.8
％
±
0.2)。
[0004]采用生物催化合成亚砜药物具有环境友好及选择性优势，但是目前报道中可催化的底物范围受限，大多是催化苯甲硫醚类底物，对较大体积底物的催化仅有奥美拉唑和兰索拉唑等拉唑类药物
。
目前能够实现大体积药物化合物硫醚氧化的蛋白质及突变体较少，因此需要开发更多的生物催化剂来催化难以实现的大体积亚砜药物的合成
。
[0005]天然的
P450
酶含有
b
型血红素，其通过氨基酸配体与血红素中心的金属铁的配位
、
氢键等非共价相互作用与蛋白质结合
。
用非天然金属卟啉替换天然
P450
酶的血红素中心的策略，可构建具有新的催化活性的人工酶
。
构建人工金属酶的关键技术之一是获得不含血红素的脱辅因子
P450
酶，传统方法主要有以下几种：利用限铁培养基直接纯化
、
酸处理脱辅因子法
、
包涵体复性纯化；但是限铁培养基方法操作繁琐，需要多步纯化并且得到的无辅因子酶含量少，酸处理脱辅因子法的
pH
难以控制极易损伤蛋白质，包涵体复性纯化的方法则受限于蛋白质的表达必须在特殊条件下可以生成包涵体
。
[0006]为了实现蛋白质与非天然卟啉的高效组装，尤其是体内组装，
Eric M Brustad
等发展了正交蛋白质
‑
辅酶对的方法，通过理性设计，引入与天然血红素有空间位阻的突变位点，得到了特异性识别非天然金属卟啉，而不结合血红素的
P450 BM3
突变体，然而
Brustad
的策略使用了与天然血红素相比更小的卟啉骨架，往往与天然血红素相比具有较大取代基的卟啉的侧链基团可以提供更好的反应性，特别是当取代基为吸电子基团时，如卤素原子，通过使起催化作用的中间产物更亲电，进而产生更强的氧化性；另外一个因素是卟啉侧链
的取代基一定程度上能降低金属卟啉本身自氧化现象对其活性的影响；同时较大取代基的卟啉还可以降低催化过程中形成的高价金属
‑
氧化物的能量
。
但目前尚未报道可以容纳大体积的非天然卟啉的人工酶
。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种可容纳非天然金属卟啉的细胞色素突变体
、
人工金属酶及应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过以
P450 BM3
为研究对象，通过理性设计得到可以容纳非天然金属卟啉的
P450 BM3
突变体，以及容纳大体积的非天然卟啉的人工金属酶，该人工金属酶实现了温和条件下的大位阻底物阿苯达唑的硫醚氧化修饰
。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0009]本专利技术提供一种细胞色素突变体，其包括
P450 BM3 I357AL86G
和
P450 BM3 I357A
Δ
L86
，其中所述
P450 BM3 I357AL86G
为细胞色素
P450 BM3
多肽序列第
357
位异亮氨酸突变丙氨酸
、
第
86
位亮氨酸突变为甘氨酸
、
以及第
400
位的轴向半胱氨酸突变为丝氨酸；所述
P450 BM3 I357AL86G
的氨基酸序列如
SEQ ID NO
：3所示；所述
P450 BM3 I357A
Δ
L86
为
SEQ ID NO
：3所示多肽序列第
357
位异亮氨酸突变丙氨酸
、
第
86
位亮氨酸缺失
、
以及第
400
位的轴向半胱氨酸突变为丝氨酸；所述
P450 BM3 I357A
Δ
L86
的氨基酸序列如
SEQ ID NO
：4所示
。
[0010]所述
P450 BM3 I357AL86G
的氨基酸序列为：
TIKEMPQPKTFGELKNLPLLNTDKPVQALMKIADELGEIFKFEAPGRVTRYLSSQRLIKEACDESRFDKNLSQALKFVRDFAGDGGFTSWTHEKNWKKAHNILLPSFSQQAMKGYHAMMVDIAVQLVQKWERLNADEHIEVPEDMTRLTLDTIGLCGFNYRFNSFYRDQPHPFITSMVRALDEAMNKLQRANPDDPAYDENKRQFQEDIKVMNDLVDKII本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种细胞色素突变体，其特征在于，其包括
P450 BM3 I357AL86G
和
P450 BM3 I357A
Δ
L86
，其中所述
P450 BM3 I357AL86G
为细胞色素
P450 BM3
多肽序列第
357
位异亮氨酸突变丙氨酸
、
第
86
位亮氨酸突变为甘氨酸
、
以及第
400
位的轴向半胱氨酸突变为丝氨酸；所述
P450 BM3 I357AL86G
的氨基酸序列如
SEQ ID NO
：3所示；所述
P450 BM3 I357A
Δ
L86
为
SEQ ID NO
：3所示多肽序列第
357
位异亮氨酸突变丙氨酸
、
第
86
位亮氨酸缺失
、
以及第
400
位的轴向半胱氨酸突变为丝氨酸；所述
P450 BM3 I357A
Δ
L86
的氨基酸序列如
SEQ ID NO
：4所示
。2.
如权利要求1所述细胞色素突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：分别将编码所述
P450 BM3 I357AL86G
和
P450 BM3 I357A
Δ
L86
的基因转入质粒，构建重组质粒；将所述重组质粒转化感受态大肠杆菌，于2×
YT
培养基中培养并用
IPTG
诱导蛋白表达，经
Ni
‑
NTA
亲和层析纯化，分别得到细胞色素突变体
P450 BM3 I357AL86G
和
P450 BM3I357AL86G。3.
如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，编码所述
P450 BM3 I357AL86G
和所述
P450 BM3 I357A
Δ
L86
的基因的核苷酸序列分别如
SEQ ID NO
：1和
SEQ ID NO
：2所示
。4.

【专利技术属性】
技术研发人员：于洋，袁飞燕，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：