一种催化活性提高的制造技术

本发明专利技术属于基因工程和酶工程技术领域，公开了一种催化活性提高的

【技术实现步骤摘要】
一种催化活性提高的C11
α
‑
羟化酶突变体、方法及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程和酶工程
，尤其是一种催化活性提高的
C11
α
‑
羟化酶突变体
、
方法及其应用
。

技术介绍

[0002]甾体化合物结构多样且种类众多，具有独特的生理和药理活性，在临床治疗上不可或缺
。
甾体药物被广泛应用于抗炎
、
抗毒
、
抗过敏等，同时也可用于治疗癌症
、
生育控制以及人体激素分泌障碍
。
甾体骨架特定位点引入官能基团是决定药效的关键，目前常用的方法有化学合成法
、
微生物转化法和半合成法
。
与化学合成法相比，微生物转化法不仅具有专一性强
、
合成步骤少
、
生产周期短
、
副产物少
、
对环境友好等优势，而且具有高度的立体选择性和区域选择性，能对甾体药物母核上化学合成法难以或无法实现的惰性位点引入特定官能团
。
在甾体激素药物的生产中，微生物转化法已经成为诸多甾体药物或药物中间体合成路线中的关键技术
。
[0003]11
α
,17
α
‑
双羟基黄体酮是以
17
α
‑
羟基黄体酮为原料经过生物发酵制备的甾体激素类药物中间体，以它为原料可以制备多种增强身体机能
、
提高免疫力
、
抗凝血等作用的皮质激素药物，如地塞米松
、
倍他米松
、
氢化可的松
、
氢化泼尼松
、
醋酸氢化可的松
。
目前工业上主要利用赭曲霉
(Aspergillus ochraceus)
转化
17
α
‑
羟基黄体酮生成
11
α
,17
α
‑
双羟基黄体酮
。
然而，赭曲霉在转化后期存在积累色素和毒素等问题，这不仅明显提高了分离精制的成本，而且严重影响了产品质量
。
另一方面，赭曲霉的遗传背景不清晰，分子操作工具不成熟
。
相比之下，酿酒酵母作为真核模式微生物，以其自然优势而闻名，如生长快速
、
遗传背景清晰
、
基因操作成熟和使用安全
。
[0004]甾体
11
α
羟化酶属于细胞色素
P450
酶超家族，其结构主要由胞质结构域
、
跨膜结构域和辅基血红素组成
。
其中，血红素堆叠在
I
和
L
螺旋之间，位于相对较大的口袋中，通过与近端半胱氨酸残基结合的硫醇铁的配位结合连接到蛋白质骨架上，周围有疏水性氨基酸残基以容纳疏水性底物
。
甾体羟化酶是一种膜结合蛋白，疏水性强，在水中趋向于聚合而不易形成结晶，分离纯化工作十分困难
。
近年来，研究者将不同来源
11
α
羟化酶基因在大肠杆菌
(Escherichia coli)、
酿酒酵母
(Saccharomyces cerevisiae)、
毕赤酵母
(Pichia pastoris)
中异源表达并进行功能鉴定，但关于羟化酶关键氨基酸位点及其分子改造的报道较少
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种催化活性提高的
C11
α
‑
羟化酶突变体
、
方法及其应用
。
[0006]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007]一种催化活性提高的
C11
α
‑
羟化酶突变体
D118V
，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.4
所示，相应核苷酸序列如
SEQ ID NO.5
所示
。
[0008]较优地，所述
C11
α
‑
羟化酶来源于赭曲霉
Aspergillus ochraceus。
[0009]编码如上所述的
C11
α
‑
羟化酶突变体
D118V
的基因
。
[0010]携带如上所述的基因的重组载体
。
[0011]进一步地，表达载体包括但不限于
pYES2。
[0012]表达如上所述的突变体，或携带如上所述的基因，或含有如上所述的重组载体的基因工程菌
。
[0013]如上所述的基因工程菌，宿主细胞包括原核生物和真核生物，所述原核生物优选为大肠杆菌；所述真核生物优选为酿酒酵母
、
毕赤酵母；更优选地，所述酵母菌为酿酒酵母
。
[0014]一种提高
C11
α
‑
羟化酶催化活性的方法，氨基酸序列在
SEQ ID NO.1
所示的序列基础上进行突变：第
118
位氨基酸由原来的天冬氨酸突变成缬氨酸
。
[0015]一种利用如上所述的基因工程菌生产目标产物的方法，所述生产方法包括如下步骤：
[0016]将所述工程菌接种于装有
YEPD
液体培养基的三角瓶中，
28
‑
35℃
，
180
‑
250r/min
条件下振荡培养
18
‑
24h
后加入底物，加入体积终浓度为
1.0
％
‑
5.0
％的甲醇助溶，并投加体积终浓度为
1.0
％
‑
5.0
％的质量浓度为
20
％半乳糖溶液进行诱导，每
18
‑
24h
补加一次；在
28
‑
35℃
，
180
‑
250r/min
条件下转化完全后，得到含有目标产物的转化液，加入乙酸乙酯萃取，得到含有目标产物的上清液
。
[0017]进一步地，所述底物为
17
α
‑
羟基黄体酮，添加终浓度范围为
0.2
‑
5.0g/L。
[0018]如上所述的突变体
D118V、
或所述的重组载体
、
或所述的基因工程菌在
C11
α
羟化反应中的应用
。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种催化活性提高的
C11
α
‑
羟化酶突变体
D118V
，其特征在于：其氨基酸序列如
SEQ ID NO.4
所示，相应核苷酸序列如
SEQ ID NO.5
所示
。2.
编码如权利要求1所述的
C11
α
‑
羟化酶突变体
D118V
的基因
。3.
携带如权利要求2所述的基因的重组载体
。4.
根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：表达载体包括但不限于
pYES2。5.
表达如权利要求1所述的突变体，或携带如权利要求2所述的基因，或含有如权利要求3所述的重组载体的基因工程菌
。6.
如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于：宿主细胞包括原核生物和真核生物
。7.
一种提高
C11
α
‑
羟化酶催化活性的方法，其特征在于：氨基酸序列在
SEQ ID NO.1
所示的序列基础上进行突变：第
118
位氨基酸由原来的天冬氨酸突变成缬氨酸
。8.
一种利用如权利要求5所述的基因工程菌生产目标产物的方法，其特征在于：所述生产方法包括如下步骤：将所述工程菌接种于装有
YEPD

【专利技术属性】
技术研发人员：骆健美，王敏，陈文慧，郑婷婷，史京辉，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：