【技术实现步骤摘要】
一种赖氨酸位点突变的KMO蛋白突变体的应用
[0001]本申请涉及生物化学
，尤其涉及一种赖氨酸位点突变的KMO蛋白突变体的应用。
技术介绍
[0002]抗氧化防御能力的下降使人和动物容易遭受氧化应激导致的肝脏损伤和疾病，给人类健康和畜牧生产造成巨大损失。犬尿氨酸
‑3‑
单加氧酶(Kynurenine
‑3‑
monooxygenase，KMO)是色氨酸代谢通路上的一种重要的代谢酶和药物靶点，可以将犬尿氨酸(Kynurenine，KYN)羟基化为3
‑
羟基犬尿氨酸(3
‑
Hydroxykynurenine，3
‑
HK)，该化合物可以通过犬尿氨酸酶(Kynureninase，KYNU)进一步羟基化形成3
‑
羟基邻氨基苯甲酸(3
‑
Hydroxyanthranilic acid，3
‑
HAA)。3
‑
HAA和3
‑
羟基犬尿氨酸(3
‑
Hydroxykynurenine，3
‑
HK)都是自由基发生器和神经毒性代谢产物，因此可导致氧化应激和神经变性。2
‑
氨基
‑3‑
羧基粘康酸半醛(2
‑
Amino
‑3‑
carboxymuconate semialdehyde，ACMS)是在3
‑
羟基邻氨基苯甲酸酯
‑>3，4
‑
双加氧酶(3
‑
Hydroxyanthranilate
‑
3,4
‑
dioxygenase，HAAO)的催化下进一步沿着该途径形成的。ACMS可形成NAD
+
前体喹啉酸(QUIN)并最终生成NAD
+
。因此，KMO在确保促氧化剂(QUIN，3
‑
HK，吡啶甲酸)和抗氧化剂犬尿酸(Kynurenic acid，KYNA)等犬尿氨酸代谢产物之间的平衡方面起着关键作用。
[0003]KMO位于线粒体外膜，其表达主要局限于肝脏、肾脏、一些单核细胞和大脑内的小胶质细胞。KMO的抑制将KYN的代谢从3
‑
HK分流到KYNA，且已被发现可使病理性KP失衡正常化并改善疾病表型。并且，与野生型相比，KMO敲除则对应的小鼠肝脏中的3
‑
HK水平降低，但KYN、KYNA和邻氨基苯甲酸(Anthranilic acid，AA)水平增加。此外，KMO抑制已显示可增强犬尿氨酸氨基转移酶(Kynurenine aminotransferase，KATs)活性，促进其催化产物KYNA的生成。
[0004]相反地，KMO的上调将导致具有活性氧(Reactive oxygen species，ROS)生成特性的代谢物的形成，研究发现，与正常肝细胞系L02相比，KMO在人肝癌细胞HCC中的表达异常升高，而KMO敲除可以显著降低HCC细胞在体外的迁移和侵袭率，且从肝硬化发展到肝癌过程中，肝组织的KMO表达逐渐增加。
[0005]因此，KMO蛋白的表达对提高人体和动物的机体抗氧化水平和健康状况密切相关，对其表达调控的研究具有重要意义。
技术实现思路
[0006]有鉴于此，本申请的目的在于提出一种赖氨酸位点突变的KMO蛋白突变体的应用。
[0007]基于上述目的，本申请一种赖氨酸位点突变的KMO蛋白突变体的应用，所述KMO蛋白突变体的赖氨酸位点发生突变，所述赖氨酸位点包括第67位的赖氨酸K67、第93位的赖氨酸K93和第179位的赖氨酸K179中的至少一个。
[0008]可选地，所述突变为：由赖氨酸突变为精氨酸。
KMO
K179R
代表的是KMO
‑
K179R重组质粒转染得到的细胞模型；Flag KMO
K67R
代表的是KMO
‑
K67R重组质粒转染得到的细胞模型；Flag KMO
K93R
代表的是KMO
‑
K93R重组质粒转染得到的细胞模型。
具体实施方式
[0023]为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本公开进一步详细说明。
[0024]需要说明的是，除非另外定义，以下实施例中所用的技术术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0025]本申请第一方面提供了赖氨酸位点突变的KMO蛋白突变体的应用，所述KMO蛋白突变体的赖氨酸位点发生突变，所述赖氨酸位点包括第67位的赖氨酸K67、第93位的赖氨酸K93和第179位的赖氨酸K179中的至少一个。所述突变为：由赖氨酸突变为精氨酸。
[0026]具体地，蛋白质的赖氨酸位点泛素化修饰对蛋白质的表达具有非常重要的作用，因此本申请中，通过KMO蛋白的赖氨酸位点发生突变来调控KMO蛋白的表达。
[0027]专利技术人经过研究发现，赖氨酸位点K67和K93可能发生泛素化修饰的概率较高，并且其在物种间保守程度高，因此将K67和K93作为候选突变位点。另外，专利技术人通过对育肥猪肝脏泛素化修饰组学分析后得到，赖氨酸位点K179上泛素化修饰水平发生显著变化，因此，将K179也作为候选突变位点。
[0028]其中，所述赖氨酸位点包括第67位的赖氨酸K67、第93位的赖氨酸K93和第179位的赖氨酸K179中的至少一个，即所述突变可以为仅K67的突变、仅K93的突变、仅K179的突变、K67和K93同时突变、K93和K179同时突变或者K67、K93和K179同时突变，具体突变的位点依据实际需要进行选择，在此不做限定。
[0029]其中所述突变为由赖氨酸突变为精氨酸。赖氨酸位点极易发生泛素化修饰，以致影响蛋白质的表达，本申请中，将KMO蛋白的赖氨酸位点发生突变，由易于发生泛素化修饰的赖氨酸突变为不易发生泛素化修饰的精氨酸，进而改变KMO蛋白的表达。
[0030]其中，K67、K93和K179中的字母K代表的是赖氨酸，数字67、93和179代表的是该位点在氨基酸序列中的位置。
[0031]将赖氨酸位点K67、K93和K179突变为精氨酸后，这些位点可用K67R、K93R和K179R表示，其中，R代表的是精氨酸，K67R代表的是将67位点的赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)，同样地，K93R代表的是将93位点的赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)，K179R代表的是将179位点的赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)。
[0032]在一些实施例中，通过全基因合成获得所述突变体的目的基因序列，而后根据所述突变体的目的基因序列进行PCR扩增，所述扩增所用引物包括：
[0033]上游引物：5
’‑
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种赖氨酸位点突变的KMO蛋白突变体的应用，其特征在于，所述KMO蛋白突变体的赖氨酸位点发生突变，所述赖氨酸位点包括第67位的赖氨酸K67、第93位的赖氨酸K93和第179位的赖氨酸K179中的至少一个。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述突变为：由赖氨酸突变K为精氨酸R。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过全基因合成获得所述突变体的目的基因序列，而后根据所述突变体的目的基因序列进行PCR扩增，所述扩增所用的引物包括：上游引物：5
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CTGGCTAGCGTT...
【专利技术属性】
技术研发人员：高杰，顾宪红，郝月，朴香淑，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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