一种维生素制造技术

本发明专利技术公开了一种维生素

【技术实现步骤摘要】
一种维生素D3的C25位羟化酶突变体及其基因工程菌与应用


[0001]本专利技术涉及一种维生素
D3
的
C25
位羟化酶突变体及其基因工程菌与应用，属于基因工程和酶工程

。

技术介绍

[0002]维生素
D3
是生物体内的一种重要脂溶性维生素，其主要作为钙磷调控的前体物质，生物体内的7‑
脱氢胆甾醇在紫外波长的照射下，环戊烷多氢菲
C9
位开环形成
VD3
的结构，
VD3
在体内不具有生物活性
。
而
VD3
在人体中经过羟基化反应可以生成两种活性形式，分别是
25(OH)VD3
和1α
,25(OH)2VD3。
其中，
25(OH)VD3
是它的主要活性形式，骨化二醇，又称为
25
‑
羟基维生素
D3[25(OH)VD3]，属于维生素
D3
的一种具有生物活性的衍生物，在人体内吸收很快，具有调节钙磷平衡
、
提高免疫力
、
预防骨质酥松
、
抗软骨病等作用
。
[0003]随着人类对活性
VD3
的需求日益增多，传统化学合成法需要考虑到区域选择性和立体选择性在
C1
与
C25
位特异性的引入羟基，反应难度较高，过程较复杂，具有收率偏低
、
>成本高
、
环境污染严重等缺点，化学合成不适用于工业化生产
。
为了解决化学合成中的诸多问题，开发新的生产工艺十分必要
。
相比于化学合成法，微生物法具有合成步骤少
、
环境友好等特点，近年来以维生素
D3
为底物，进行
P450
酶催化被众多学者广泛专利技术
。
[0004]巨大芽孢杆菌
(Bacillus megaterium)H
‑1中含有
C
‑
25
位的羟化酶
CYP109E1
‑
H
可以选择性催化底物维生素
D3
生成产物
25(OH)VD3。
该过程主要是由细胞色素
P450
酶系所介导的，具体是经过细胞色素
P450
羟化酶
(CYP)
催化反应进行，同时也需要氧化还原伴侣
(RPs)
协助完成电子传递，并由辅酶
NADPH
提供电子
。
而巨大芽孢杆菌
(Bacillus megaterium)H
‑1的
P450
氧化还原酶及其还原酶的表达量均很低，从而极大地限制了
25(OH)VD3
的生产
。
[0005]因此，采取基因组学，生物信息学分析和代谢工程等方法相结合，挖掘和鉴定更多新的可溶性表达的酶基因并进行改造，筛选出能够对底物进行高效转化的
P450
酶是具有非常重要的工业意义的
。

技术实现思路

[0006]本专利技术在于提供一株
VD3
羟化酶突变体的工程菌株，提供该突变体的基因及包含该突变体基因的重组质粒及包含该重组质粒的宿主细胞，实现了
VD3
羟化酶的增强表达，相应的突变体进行异源表达并且能够有效转化
VD3
转化为
25(OH)VD3。
通过筛选电子传递链体系，发现
CYP
与特定的电子传递链体系在特定宿主中表达能有效提高
25(OH)VD3
的产量，亲本巨大芽孢杆菌
H
‑1的
CYP109E1
‑
H
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示
。
[0007]本专利技术的第一个目的是，提供一种维生素
D3
的
C25
位羟化酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如
SEQ ID NO.4
所示；本专利技术将该突变体命名为
CYP109E1
‑
H1。
[0008]在一种实施方式中，所述的维生素
D3
的
C25
位羟化酶突变体是将氨基酸序列如
SEQ ID NO.2
所示的亲本巨大芽孢杆菌
H
‑1的
CYP109E1
‑
H
的第
293
位组氨酸替换为丙氨酸得到
的
。
[0009]本专利技术的第二个目的是，提供编码上述
C25
位羟化酶突变体的核苷酸序列，可选地，所述核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示
。
[0010]本专利技术的第三个目的是，提供用于表达上述维生素
D3
的
C25
位羟化酶突变体的重组表达质粒，所述质粒含有维生素
D3
的
C25
位羟化酶突变体的核苷酸序列
。
[0011]可选的，所述重组质粒是在
pMA5
的基础上构建得到的
。
[0012]本专利技术的第四个目的是，提供一种基因工程菌，所述工程菌整合有
C25
位羟化酶突变体的核苷酸序列或含有上述的重组表达质粒
。
[0013]在一种实施方式中，所述基因工程菌以
pMA5
质粒为表达载体
。
[0014]在一种实施方式中，所述宿主微生物包括枯草芽孢杆菌
。
[0015]进一步的，所述宿主微生物为枯草芽孢杆菌
WB600。
[0016]更进一步的，所述工程菌株是以
pMA5
为表达载体，将突变后的
CYP109E1
‑
H1
基因整合到表达载体
pMA5
中，并将
pMA5
转入宿主枯草芽孢杆菌
WB600
中构建得到的，将其命名为枯草芽孢杆菌
WB600
‑
pMA5
‑
CYP109E1
‑
H1。
[0017]在一种实施方式中，所述基因工程菌含有铁氧还原蛋白酶基因和铁氧还原蛋白还原酶基因，或含有铁氧还原蛋白酶和铁氧还原蛋白还原酶的重组表达质粒
。
[0018]可选的，铁氧还原蛋白酶基因和铁氧还原蛋白还原酶基因的氨基酸序列分别如
SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8
所示
。
[0019]可选地，铁氧还原蛋白酶基因和铁氧还原蛋白还原酶基因的基因序列分别如
SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种维生素
D3
的
C25
位羟化酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如
SEQ ID NO.4
所示
。2.
编码权利要求1所述的
C25
位羟化酶突变体的核苷酸序列
。3.
一种用于表达权利要求1所述的维生素
D3
的
C25
位羟化酶突变体的重组表达质粒
。4.
根据权利要求3所述的重组表达质粒，其特征在于，所述质粒含有权利要求2所述的核苷酸序列
。5.
一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌整合有权利要求2所述的
C25
位羟化酶突变体的核苷酸序列或含有权利要求3所述的重组表达质粒
。6.
根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述工程菌以
pMA5
质粒为表达载体，以枯草芽孢杆菌
WB...

【专利技术属性】
技术研发人员：李会，何于琳，许正宏，史劲松，张晓梅，龚劲松，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：