蛋白质生产方法技术

公开了用于改变蛋白质例如抗体的细胞分泌速率的方法，以及通过该方法生产的改变的细胞。此方法及改变的细胞用于生产高水平的用于治疗、诊断或研究目的的蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及改变蛋白质细胞分泌速率的方法。
技术介绍
蛋白质例如抗体的大规模生产通常依赖于蛋白质自培养的生产 细胞系的分泌。可容易的自周围细胞培养基回收及纯化培养细胞产 生的分泌性蛋白质。蛋白质的细胞表达速率是影响自生物反应器或其他体系生产和 纯化分泌性蛋白质的一个重要参数。通常，如果细胞表达比较高则 可获得更高纯度的蛋白质产量。相反，如果细胞表达速率过低则蛋 白质可能不适于纯化。分离高表达、亚克隆细胞。通常，需要有限的系列稀释、高表达细 胞系筛查和选择的数个费时、费力的循环。或者，制备产目的蛋白 的全新的细胞系并希望产生的新细胞系为高表达细胞系。上述每个制备高表达细胞系的方法均有局限性。例如，高表达 细胞在群体中相对稀少以及鉴别任何高表达细胞均需要大量时间和 劳力限制了从大量低表达细胞中通过亚克隆鉴别高表达细胞系。进一步的，新细胞系不是高表达的可能性以及再生产生抗体的 细胞和鉴别高表达细胞将需要非常大量的劳力限制了产生抗体或感 兴趣蛋白质的新细胞系的制备。在一些实例中，尽管努力获得高表 达细胞系但仅可得到低表达细胞系。因此需要改变蛋白质的细胞分泌速率的有效方法。附图简述附图说明图1显示相对于Sp2/0亲代骨髓瘤细胞系在高表达细胞系中提高了的SLPI基因转录水平。图2显示相对于Sp2/0亲代骨髓瘤细胞系在高表达细胞系中提高 了的CD53基因转录水平。图3显示相对于Sp2/0亲代骨髓瘤细胞系在高表达细胞系中增加 了的转4失蛋白-l生成。图4显示相对于C463a亲代骨髓瘤细胞系在高表达细胞系中提 高了的SLPI基因转录水平。图5显示在C463a衍生亚克隆中抗体产生增加时SLPI基因转录 水平逐渐增加的趋势。图6显示相对于C463a亲代骨髓瘤细胞系在高表达细胞系中增加了的转铁蛋白-1基因转录水平。图7显示在C463a衍生亚克隆中抗体产生增加时转铁蛋白-1基因转录水平逐渐增加的趋势。专利技术概述本专利技术的 一个方面是一种改变蛋白质细胞分泌速率的方法，包 括调节至少一种选自细胞中分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)、 CD53或转铁蛋白-1的分子的活性及培养细胞的步骤。本专利技术的另 一个方面是一种带有改变细胞分泌速率的骨髓瘤细 胞，通过调节至少一种选自细胞中分泌性白细胞蛋白酶抑制剂 (SLPI)、 CD53或转铁蛋白-1的分子的活性及培养细胞的步骤生成。专利技术详述说明书中引用的包括但不限于专利和专利申请书的所有公开通 过引用其全部内容结合到本文中。文中所用"抗体"指其宽广的含义且包括免疫球蛋白或抗体分 子，包括多克隆抗体，单克隆抗体，包括鼠类、人、人源化及嵌合 单克隆抗体及抗体片段或变异体。抗体为构成性表达的分泌性蛋白 质且通过浆细胞分泌。也可4吏用无限增殖化浆细胞通过标准方法例 如杂交瘤增殖或通过将抗体重链或轻链基因转染入无限增殖化B细胞例如骨髓瘤细胞或其他细胞类型例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、植 物细胞及昆虫细胞产生抗体。抗体片段或变异体包括模拟抗体(mimetibodie)、 Fab片段、F (ab')2 片段、Fc片段、重链片段、轻链片段和含有至少一种抗体肽链的一 部分的分子。这些部分可与抗体可变区、铰链区或恒定区肽链相对 应。文中所用术语"模拟抗体"指具有通式(I)的蛋白质 (Vl(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n》(m)(I)其中VI至少为免疫球蛋白可变区N-末端的一部分，Pep为至少一种 结合到表位的活性肽，Flex为使模拟抗体具有选择定向及结合特性 提供结构柔性的多肽，V2至少为免疫球蛋白可变区C-末端的一部 分，pHinge至少为免疫球蛋白铰链区的一部分，CH2至少为免疫球 蛋白CH2恒定区的一部分且CH3至少为免疫球蛋白CH3恒定区的 一部分，其中n和m可为1-10间的整数。模拟抗体可依靠构建体中 存在的重链恒定区氨基酸序列摹拟不同类型免疫球蛋白分子例如 IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA、 IgM、 IgD及IgE的性质和功能。文中所用术语"单克隆抗体"(mAb)指得自大量基本同源抗体的 抗体(或抗体片段)。单克隆抗体是高度特异的、通常定向于单一抗原 决定簇。修饰语"单克隆"表示抗体的基本同源特性且不需要任何 特定方法产生抗体。例如，可通过Kohler等,淑騰256: 495 (1975) 的杂交瘤方法制备鼠类mAbs。可通过美国专利No. 4，816, 567公开 的方法制备含有得自供体抗体(通常为鼠)的轻链和重链可变区以及得 自受体抗体(通常为另 一种哺乳动物种例如人)的轻链和重链恒定区的 嵌合mAbs。可通过Queen等，iV加/爿cad Scz (USA), 86: 10029-10032, (1989)和Hodgson等，S/o/rec^o/ogy, 9: 421, (1991)中公开的技 术获得人源化mAbs,其具有得自非人供体免疫球蛋白(通常为鼠)的 CDRs及余下的分子的免疫球蛋白来源的部分得自 一种或多种人免疫球蛋白，任选具有改变的构架支持体残基以保存结合亲和力。可参考例如Lonberg等，iV"rt^ 368 : 856-859, (1994); Fishwild等， 淑廳胸ec/wo/ogy 14 : 845-851, (1996)'及Mendez等，淑, Ge""/" 15 : 146-156， (1997)中技术自人免疫球蛋白转基因鼠制备缺 乏非人序列的完全人mAbs。也可通过参考例如Kn叩pik等，A/o/. 5/o/. 296 : 57-86, (2000)和Krebs等，/wmw"o/. A/e仇254: 67- 84, (2001)中技术自噬菌体展示文库制备及优化人mAbs。本文所用术语"细胞表达水平"指细胞在整个生存期能表达的 给定蛋白质的量。这个量可描述为每段时间变量内培养基中存在的 蛋白质量的变化(即"体积生产率"("volumetric productivity"))或者 可标准化为细胞数目(即"特定生产率"("specific productivity"))。可 用单位"mg/ml/天"表示"体积生产率"而可用单位"pg/细胞/天" 表示"特定生产率"。本专利技术提供了适于改变细胞蛋白质细胞表达的量的方法。本发 明方法的示例性应用是增加适于治疗、诊断或研究目的的蛋白质例 如抗体的表达量。高通量cDNA微阵分析提供一种鉴别通常在不同高表达、产抗体细胞系中受调节的基因的技术。这种分析显示所有已知鼠类基因 中，不到0.1%通常在具高分泌速率的不同SP2/0及C4Ma衍生鼠类 骨髓瘤细胞系中受到调节。编码分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI) (Genbank检索号NM 011414), CD53(Genbank检索号NM 0C)7651)及 转铁蛋白-l(Genbank检索号J03299)蛋白质的基因属于这种通常受调 基因的精选组。在cDNA微阵分析中发现这些基因在所检测的SP2/0 及C463a衍生高表达细胞系中增量调节。相对于亲代鼠类骨髓瘤细 胞系在所检测的高表达细胞系中这些基因均增量调节至至少1.5倍。SLPI蛋白通过诱导细胞周期蛋白D,减量调节TGF-P，且抑制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改变蛋白质表达水平的方法，包括步骤：ａ）调节细胞中至少一种选自分泌性白细胞蛋白酶抑制剂（ＳＬＰＩ）、ＣＤ５３或转铁蛋白－１的分子的活性；及ｂ）培养该细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：H多赖，
申请(专利权)人：森托科尔公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]