本发明专利技术公开了猪ＴＴ病毒１型ＣＪＮＹ株的完整核苷酸序列，属生物技术领域。该序列长２８７９个碱基。与已报道的三株完整基因组序列的ＴＴ病毒１型（ＧＱ１２０６６４、ＡＹ８２３９９０和ＡＢ０７６００１）的核苷酸同源性为６８．１％－８６．７％，最大不同在于该序列所编码的病毒核衣壳蛋白仅有４１５个氨基酸，与其它三株相比大大减少。这些序列可用于特异的检测技术研究与开发，以及通过构建感染性分子克隆用于病毒生物学特性的研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及猪TT病毒1型(TTVl) CJNY株(指环病毒属(AnelIovirus))的核苷酸序列，属于生物
技术介绍
1997年日本学者Nishizawa等运用代表性差异分析技术(Itepresentational diference allalysis)，从一例非甲——非庚型输血后肝炎患者的血清中克隆到一个 500bp的片段N22。通过分子流行病学研究，证实了 N22与输血后肝炎有高度相关性。由于 该克隆来源于这名姓名为TT的输血后肝炎患者，认为该病毒与肝炎有关，故命名为TT病 毒，因TTV与经输血传播病毒(transfusion transmitted virus, TTV)英语单词的三个字 首字母缩略词巧合，因此，该病毒又称输血传播病毒。TTV是一种无囊膜的单股环状负链的球形DNA病毒，目前归指环病毒属 (Anellovirus)，直径为30nm 32nm。TTV基因组长3. 6kb 3. 8kb，分为编码区和非编码 区(UTR)两部分，非编码区特定区域内核酸序列十分保守，此区域可能与病毒的复制及蛋 白质的表达有关。TTV编码区由6个开放阅读框架(0RF1 0RF6)组成，其中ORFl和0RF2 相对研究得比较清楚，ORFl位于该基因组的589位 2898位核苷酸，编码770个氨基酸， 为病毒的衣壳蛋白，具高度亲水性；0RF2位于107位 712位核苷酸，编码202个氨基酸， 为病毒的非结构蛋白，与病毒复制有关；此外，0FR3编码剪接蛋白，为TTV所必须。TTV在各类人群中感染比例非常高，据各国对不同人群TTV感染的流行病学调查， 欧美等发达国家正常献血者的感染率约33% 76%，亚洲、非洲和南美洲等正常献血者的 感染率为90 % 100 %。TTV的感染率虽然不低，但总的来讲，绝大多数TTV感染者都表现为 无症状的携带者，无明显的肝炎生化改变，肝穿活检亦无明显病理变化。在少数有ALT (谷 丙转氨酶)升高的病例中，TTV也常被较快清除而表现为急性的或一过性的感染。但也有 报道提示TTV感染和暴发型肝炎、肝炎后肝硬化等有一定的关系。TTV感染后能否引起肝脏 炎症反应，目前报道结果各异，存在较大争议。除了人感染TTV以外，已经证实TTV感染宿主很广，包括灵长类动物(黑猩猩、类 人猿和猴)、家畜(猪、牛、羊、犬、猫、鸡)和其它动物(老鼠、兔和骆驼)。TTV主要通过输 血、性接触和粪一口等途径传播，在血液、唾液、粪便和乳汁等分泌物和排泄物中能检测 到病毒。在目前对家养动物的TTV感染研究中，针对猪TTV感染的研究较多。至今为止，在 猪体内有两种明显不同的TTV基因型被证实，分别是基因1型和基因2型(TTV1和TTV2)， 两者基因组长度及其开放阅读框的位置与人的TTV不尽相同。同人类的感染状况相似，猪 的TTV感染率也很高。猪TTV的两种基因型已经在猪血清、血浆、精液、粪便、鼻腔和直肠棉 拭中被检测到。TTV在猪群中广泛传播，同样，粪一口途径被认为是病毒传播的主要途径。由于TTV归类于圆环病毒科(Circoviridae)，而同科病毒猪圆环病毒2型(PCV2) 是目前影响猪群健康的重要传染病——猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的病原，由此引发兽 医界人士的联想，在PCV2引起的断奶后仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)等临床病症的过程中，TTV或许参与了协同作用或次要角色。McKeown等认为TTV与猪的其它已知病原共感 染可导致疾病严重化。Krakowka等对2 4日龄的无菌猪接种TTV1，于1周后再分别接种 PCV2和PRRSV，对照组则分别单独接种TTV1、PCV2和PRRSV，结果TTVl和PCV2混合接种组 的仔猪中50%发展为急性PMWS感染，TTVl和PRRSV混合接种组的仔猪死亡率达到23%， 并呈现PRRS的典型病症，而对照组均未产生PRRS或PMWS的临床病变，说明TTVl可能参与 了猪的PCV2和PRRS的感染。虽然TTV在PMWS等疾病的发展中可能扮演了一定角色，但由于上述研究用的是猪 感染TTVl的病料，很难排除掉病料本身是否含有其它病原的可能。因此，对于研究TTVl的 生物学特性，必须有TTVl某一特定毒株的完整核苷酸序列和有效性的全长克隆。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是确定猪TTVl JSNY毒株的完整核苷酸序列。本专利技术的另一目的是 确定3个基因推导的氨基酸序列。技术方案猪TT病毒1型CJNY株基因组的核苷酸序列，其特征为SEQ ID NO :1，其所编码的 蛋白质，具有序列为=SEQ ID NO :2。所述猪TT病毒1型CJNY株基因组的0RF2编码区域，其核苷酸序列为SEQ ID NO 3，所编码的蛋白质，具有序列为SEQ ID NO :4。所述猪TT病毒1型CJNY株基因组的0RF3编码区域，其核苷酸序列为SEQ ID NO 5，所编码的蛋白质，具有序列为SEQ ID NO :6。有益效果具有一种猪TT病毒1型的完整基因组，可用于以该病毒为基础的研究和开发。本专利技术获得了由SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 5及其生物学等效物 构成完整的核苷酸序列。这些核苷酸分子编码特定的蛋白质，且选自SEQ ID NO=U SEQ IDNO 3 和 SEQ ID NO :5。编码具有选自 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 6 及其 生物学等效的氨基酸序列的蛋白质。可用于PCR技术直接测定病毒核酸，用于合成肽或表 达蛋白ELISA检测试剂，构建完整基因组的分子克隆还可用于拯救病毒等。具体实施例方式考虑到猪TTVl核苷酸序列存在高度变异情况，本专利技术以目前公开发表的三条猪 TTVl 基因组序列(Sd-TTV31，AB076001 ； lp, AY823990 ； swSTHY-TT27, GQ120664)为基础，首 先通过扩增病毒相对保守的非编码区特定区域核苷酸序列，然后根据获得的核苷酸序列再 设计一对反向引物，用来扩增病毒完整基因组的核苷酸序列。首先，按常规的酚-氯仿法提取猪血清样品DNA，即取300 μ L血清，加入等体积的裂解缓冲液及 ο μ L的蛋白酶K(10mg/mL)，50 V消化2h，加入600 μ L Tris饱和酚， 充分振荡混勻，12，000r/min，离心IOmin ；取上层水相，加入等体积的酚氯仿异戊醇 (25 24 1)混勻后，12，OOOr/min，离心IOmin ；用酚氯仿异戊醇重复抽提一次；取上 层水相，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH 5. 2)和2倍体积预冷的无水乙醇，在_20°C放置Ih 2h以沉淀病毒DNA ；12, OOOr/min，离心lOmin，弃取上清，用70%乙醇洗涤沉淀，自然风干；用无菌三蒸水溶解沉淀，-20°C保存备用。然后，按如下程序分两阶段PCR进行猪TTVl测序第一阶段PCR:引用文献所设计的引物，即上游引物 5' -CGGGTTCAGGAGGCTCAAT-3‘，下游引物5' -GCCATTCGGAACTGCACTTACT-3‘，可扩增出 TTVl 5' UTR的大约300bp的片段。PCR体系包括0. 5本文档来自技高网...
【技术保护点】
猪ＴＴ病毒１型ＣＪＮＹ株基因组的核苷酸序列，其特征为：ＳＥＱＩＤＮＯ：１。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：温立斌，何孔旺，郭容利，李成仁，倪艳秀，张雪寒，吕立新，周俊明，俞正玉，茅爱华，沈江萍，周萍，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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