本发明专利技术公开了一种从动物组织中提取单链ＲＮＡ病毒基因组的方法，包括以下步骤：（１）组织匀浆取病变组织剪碎后加入无菌水，匀浆器内高速匀浆至单细胞悬液；（２）细胞裂解、病毒释放将所得单细胞悬液反复冻融、超声破碎，使细胞裂解、病毒释放；（３）离心分离将上述处理液在低温下，离心分离，收集病毒沉淀；（４）ＲＮＡ提取向沉淀物中加入ＲＮＡｉｓｏ Ｒｅａｇｅｎｔ试剂，重悬，分离后提取得到ＲＮＡ。用本发明专利技术提取病毒基因组ＲＮＡ既可以避免宿主细胞物质的干扰，又可以得到高丰度、高纯度、高完整性的病毒ＲＮＡ，方便后续实验。用于病毒检测，可以检测到极微量病毒离子的存在。本发明专利技术为动物源性病毒病的诊断、监控提供了新的途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种从动物组织中提取病毒基因组RNA的方法，属于微生物 病原检测
技术背景随着动物贸易的飞速发展，养殖业养殖规模、养殖密度越来越高，也带 来了大规模的动物疾病频频爆发。2004年爆发的禽流感及2006年爆发的猪高 致病性蓝耳病给养殖业造成了致命创伤。当前，养殖业的疾病爆发呈现多病 原混合感染特点，爆发周期越来越短，对病原的诊断检测提出了更高的要求。 现有技术中，对动物病原的诊断主要方法是首先分离病菌或病毒，然后分 析病原的生理生化特性，再进行基因组学、蛋白质组学研究。而对于病毒， 尤其是突发的新病毒，进行病原的分离鉴定需要一个非常长的时间，而且极 易对研究人员造成危险。放射免疫法、酶联免疫分析或免疫电镜法总体而言 缺乏检测低浓度病毒的灵敏度，加上病毒高变异性的特点，常用的血清学及 免疫学诊断方法往往造成漏检。目前，采用聚合酶链反应(PCR)对DNA或逆 转录聚合酶链反应(RT-PCR)来检测RNA病毒方法具有最好的敏感性。但是 相对于DNA病毒来说，RNA病毒在处理过程中死亡，组织以及环境中存在的大 量RNA酶会快速降解其基因组；病毒含量极少时往往得不到完整的病毒RNA。国内他人的实验研究直接提取少量组织、血液或尿囊液中的RNA进行检 测，同样因为处理样品量太小的原因，不能提取得到完整的病毒基因组RNA， 进而无法检测到极微量的病毒。为此，研制一种简单灵敏的病毒基因组RNA 提取方法对于重大畜禽疾病的早期测具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从动物组织中提取病毒基因组RNA的方法，解 决了当前各种检测、诊断病毒方法中耗时长、灵敏度低的问题。 本专利技术的方法包括以下步骤(1) 组织匀浆取病变组织剪碎后加入无菌水，匀浆器内高速匀浆至单细胞悬液；(2) 细胞裂解、病毒释放将单细胞悬液反复冻融、超声破碎，使细胞裂解、病毒释放出来；(3) 离心分离 将上述处理液在低温下离心分离，收集病毒沉淀；(4) RNA提取向沉淀物中加入RNAiso Reagent试剂，重悬，分离后提取得到RNA。 在本专利技术的步骤(3)中，离心分离时，控制温度4t:，首先低速离心分离去除宿主细胞物质，然后再高速离心分离收集病毒沉淀，效果更好。利用随机或者特异引物RT-PCR扩增基因，扩增产物经序列测定及生物信息学研究，结果显示用该方法提取RNA病毒基因组既可以避免宿主细胞物质的千扰，又可以得到高丰度、高纯度、高完整性的病毒RNA，方便后续实验研究。利用本专利技术从ELISA试剂盒鉴定为猪繁殖与呼吸综合症病毒阴性的猪肝 脏提取RNA， lmLRNAiso Reagent可提取0D260/280值为2. 0左右的RNA约 250吗，进行琼脂糖凝胶电泳分析后可得到清晰的RNA条带；根据GenBank 公布的ATCC VR2332全基因序列设计GP5及N蛋白的引物各1对，经RT-PCR 后电泳观察到大小分别约600bp和400bp的基因片段；测序后进行同源性比 较，与ATCC VR2332目的序列的同源性分别为89. 74%、 93.83%。证明该方法 适宜于从含有极微量病毒的组织中提取大量高完整性的病毒RNA。本专利技术取得的有益效果是用该方法从组织中提取RNA病毒基因组，既 可以縮短分离、鉴定病毒所耗费的时间，又可以获得丰度高、完整性好而且 极少细胞RNA污染的RNA样品；本专利技术克服了以往方法操作中对实验检验人 员的大量危害，并且节约了开支；处理样品量大，检测下限远低于目前常用 方法。 附图说明图l是PRRSV各目的基因的RT-PCR产物电泳结果图。图中2.1， 2.2， 2, 3， 4, 5, 6和7分别代表NSP2.1, NSP2.2， GP2， GP3, GP4， GP5, M及N蛋白基因的RT-PCR扩增产物，M. DNA marker: 2000,1000,750， 500，250，画bp。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术。实施例1猪病肺中病毒基因组RNA的提取实验(1 )(1) 组织匀浆称取200g猪病肺，剪成碎块后加入500mL无菌水，于组织匀浆器内高速 匀浆至单细胞悬液；(2) 细胞裂解、病毒释放将匀浆液置于试剂瓶中，密封后-20°C， 15T:反复冻融三次；移取30mL 悬液于50mL无RNA酶的离心管，300W超声破碎2min，工作8s间歇8s;(3) 离心分离上述处理液控制温度4。C、 8000g离心15min，上清移至新离心管后控制 温度4。C、 35000g离心3h，弃上清，收集病毒沉淀；(4) RNA提取向沉淀中加入2mLRNAiso Reagent (lmLRNAiso Reagent/60mg沉淀)将 沉淀重悬，移入邓氏匀浆器匀浆，按RNAi so Reagent说明书要求进行RNA的 分离纯化操作得到RNA。(5) 丰度与完整性检验将RNA用60pL DEPC水溶解后，微量核酸测定仪测得0D260/280值分别为 1.98、 1.87， 200倍稀释后浓度分别为47.0jxg/mL， 42. 3吗/mL;取5拜A溶 液进行非变性琼脂糖凝胶电泳，可以观察到清晰的RNA条带。 实施例2猪病肺中病毒基因组RNA的提取实验(2 )(1) 组织匀浆称取200g猪病肺，剪成碎块后加入500mL无菌水，于组织匀浆器内高速 匀浆至单细胞悬液；(2) 细胞裂解、病毒释放将匀浆液置于试剂瓶中，密封后-20°C， 30'C反复冻融五次；移取30mL悬液于50mL无RNA酶的离心管，600W超声破碎2min，工作8s间歇8s;(3) 离心分离上述处理液控制温度4°C、 8000g离心15min，上清移至新离心管后控制 温度4。C、 35000g离心3h，弃上清，收集病毒沉淀；(4) RNA提取向沉淀中加入2mLRNAiso Reagent (lmLRNAiso Reagent/60mg沉淀)将 沉淀重悬，移入邓氏匀浆器匀浆，按RNAi so Reagent说明书要求进行RNA的 分离纯化操作提取RNA。(5) 丰度与完整性检验将RNA用30pL DEPC水溶解后，微量核酸测定仪测得0D260/280值为2. 1 ， 80倍稀释后浓度分别为23. 0吗/mL;取5pLRNA溶液进行非变性琼脂糖凝胶电 泳，观察到RNA条带呈弥散状；证明细胞裂解、病毒释放过程中条件过于剧 烈，致使部分病毒死亡，RNA释放于组织悬液中并在后续的实验操作中被降解。 实施例3兔病肝中病毒基因组RNA的提取实验(1) 组织匀浆称取50g兔病肝，剪成碎块后加入100mL无菌水，于组织匀浆器内高速 匀浆至单细胞悬液。(2) 细胞裂解将匀浆液置于试剂瓶中，密封后-2(TC， l(TC反复冻融三次；移取30mL 悬液于50mL无RNA酶的离心管，200W超声破碎4min，工作8s间歇8s。(3) 离心分离将上述处理液控制温度4。C、 8000g离心10min，上清移至新离心管后控 制温度4。C、 12000g离心30min，弃上清，收集病毒沉淀;(4) RNA提取向沉淀中加入3mLRNAiso Reagent (lmLRNAiso Reagent/60mg沉淀)将 沉淀重悬，移入邓氏匀浆器匀桨，按RNAi so Reagent本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从动物组织中提取病毒基因组ＲＮＡ的方法，其特征在于包括以下步骤： （１）组织匀浆 取病变组织剪碎后加入无菌水，匀浆器内高速匀浆至单细胞悬液； （２）细胞裂解、病毒释放 将单细胞悬液反复冻融、超声破碎，使细胞裂解、病毒释放； （３）离心分离 将上述相处理液低温下，离心分离收集病毒沉淀； （４）ＲＮＡ提取 向沉淀物中加入ＲＮＡｉｓｏ Ｒｅａｇｅｎｔ试剂，重悬，分离后提取得到ＲＮＡ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵宝华，宋杰，黄文娟，
申请(专利权)人：河北师范大学，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]
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