一种提高杂交瘤筛选效率的方法技术

本发明专利技术阐述了一种旨在提高细胞融合后筛选分泌抗原特异性抗体的杂交瘤细胞效率的方法，该方法通过使用抗原偶联的固相材料对细胞融合后的杂交瘤细胞进行筛选，筛选出分泌抗目的抗原的阳性细胞，进行克隆化培养，从而快速、简便的建立分泌抗目的抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

【技术实现步骤摘要】
专利技术所属领域 本专利技术涉及单克隆抗体制备中分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选方法，该方法的建立旨在提高杂交瘤制备过程中的筛选效率，降低人工劳动强度，縮短筛选时间。是发展单克隆抗体通量化制备的重要基础之一。专利技术背景 单克隆抗体的概念 抗体主要由B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。当机 体受抗原剌激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。将激活 的单一B细胞进行培养，得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，称为单克隆。单克隆细胞 合成针对一种抗原决定簇的抗体，就是单克隆抗体(简称单抗)。 单克隆抗体技术的基本原理 1975年德国学者Kohler和英国学者Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞在体外进行两种细胞融合，形成杂交瘤(hybridoma)细胞，这种细胞继承两种亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞无限繁殖的特性，又具有合成和分泌抗体的能力。用这种来源于单个融合细胞增殖的细胞群，可制备针对一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。后来两人凭借此项成就获得诺贝尔生理学奖。时至今日单克隆抗体技术已经走过了 30多个年头，在这30年中，单克隆抗体技术被不断发展并日臻完善，但有一个问题一直困扰着单抗制备的研究人员和制约着单抗的通量化和规模化生产，这一问题就是如何减少单抗制备过程中的人力成本，縮短单抗制备所需要的时间，从而降低单个单抗制作的成本。 杂交瘤细胞技术已经广泛应用于生命科学的各个领域，杂交瘤细胞所分泌的抗体-单克隆抗体是目前认为的最为成熟与可靠的分子识别工具，被广泛应用于生物学研究的各个领域，然而由于杂交瘤细胞株的制备周期长，所需的劳动强度高，已经成为制约杂交瘤细胞制备的重要瓶颈之一。本专利技术通过使用抗原偶联的固相介质(磁性材料)对细胞融合后的混合物进行筛选，分离出分泌抗原特异性抗体的杂交瘤细胞，然后通过半固体培养基的方法对杂交瘤细胞进行克隆化培养以进一步建立分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。该方法可以大幅度提高特异性抗体筛选的阳性率，降低筛选工作的劳动强度，縮短杂交瘤细胞制备所需要的时间，在大规模单克隆抗体制备中具有重要的应用前景。 单抗制备过程中最重要也是最为需要人力资源的一步是分泌特异性抗体的筛选工作，好的筛选方案是单克隆抗体制备成功与否的关键，目前通用的筛选方法是通过固相酶联实验(ELISA)法进行筛选，从成千上万个融合后的杂交瘤细胞中筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，随着制备过程的进行，有些不稳定的杂交瘤细胞失去了分泌特异性抗体的功能，在制备的末期甚至会失去全部的分泌特异性抗体的杂交瘤，导致单抗制备的失败。几十年来，在筛选的方法上也存在众多的改进，如通过流式细胞仪对杂交瘤细胞所分泌的抗体进行筛选，可以筛选出亲和力较高的抗细胞膜抗原的单抗，近年来蛋白芯片技术的不断成熟也为单抗的筛选提供了一些新的方法，Sawyer利用蛋白芯片结合多蛋白的复合免疫，进行单抗的制备，取得了较好的结果。但所有这些改进，对于筛选中工作量的降低都不明显。 单抗制备过程中的另外一个需要工作量较大的部分是克隆化培养，目前常用的方 法是有限稀释法，由于杂交瘤细胞的基因组的不稳定性，使得其在后续的培养中，会发生染 色体丢失现象，即使杂交瘤细胞在建株后，仍可能会丢失编码抗体的染色体，使杂交瘤细胞 失去分泌特异性抗体的能力，因此，在单抗制备初期，人们总是尽可能多的将所有阳性细胞 进行克隆化培养，以期最大限度的保留分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，从而造成了巨大的 工作量。基于这种情况，人们对细胞克隆化培养技术进行了改进，引进了半固体培养基对细 胞进行克隆，具体做法是利用商业化的甲基纤维素对欲克隆的细胞进行培养，细胞在这种 培养基中可以形成独立的细胞克隆，在克隆长到可以用肉眼识别的大小时将其挑出，进行 培养，这样得到了阳性克隆易于后面的筛选工作，从而降低了由于不分泌抗体的细胞的生 长快于分泌抗体生长的细胞而造成的分泌特异性性抗体的丢失现象。同时半固体培养基的 使用，也有利于单抗制备的机械化处理。节省人力成本。
技术实现思路
本专利技术的目的是要提供一种可以显著提高分泌特异性抗体的杂交瘤细胞的筛选 效率的方法，该目的的实现是通过偶联(包被)有靶抗原的固相材料(如磁性小球-磁珠)， 通过免疫亲和作用，将细胞融合后杂交瘤混合物中分泌抗靶抗原的特异性抗体的杂交瘤细 胞筛选出来，通过进一步的培养和克隆化培养，从而达到提高分泌特异性抗体的杂交瘤细 胞的筛选效率的目的。本专利技术提供了实现上述目标的具体方法，包括 1)提供一种将目的抗原(靶抗原)通过化学方法将其偶联到固相材料上的方法； 2)提供用上述方法偶联的固相材料对细胞融合后的杂交瘤细胞的筛选方法；3)提供用上 述方法筛选出的杂交瘤细胞的培养与克隆的方法；4)提供通过用上述方法培养克隆的杂 交瘤细胞的进一步的检测与鉴定方法。 本专利技术的第二个目的是通过这种方法，建立可以分泌针对某种抗原(抗原的种类 包括但不限于l.天然提取的蛋白；2.重组表达蛋白；3.体外合成的蛋白质中的多肽片段； 4.半抗原)的特异性抗体的杂交瘤细胞株。 本专利技术的第三个目的是提供按上述方法制备的特异性单克隆抗体在生命科学研究中的应用。在生命科学研究中，可利用已获得的单克隆抗体通过ELISA、免疫印记(WB)、免疫沉淀(IP)、抗体芯片等技术对蛋白质进行定性、定量、定位及相互作用研究。 本专利技术的第四个目的是提供按上述方法制备的特异性单克隆抗体在疾病诊断中的应用。在疾病诊断过程中，可利用已获得的单克隆抗体通过ELISA、免疫印迹(WB)、免疫层析、时间免疫荧光分辨、液相芯片等技术完成对肿瘤、感染性疾病的快速诊断。 本专利技术的第五个目的是提供按上述方法制备的特异性单克隆抗体在疾病治疗中的应用。在疾病治疗中，可利用已筛选到具有治疗价值的单克隆抗体进行人源化改造用于人体肿瘤、病毒感染性疾病(例如HIV、HCV等的传染)的治疗。 本专利技术的第六个目的是通过该方法的使用，可以大幅度的降低单克隆抗体制备过 程中的研究人员的劳动强度，縮短单克隆抗体制备所需的时间。 本专利技术所涉及的提高单克隆抗体制备效率的方法，特别是细胞融合后采用免疫学 的方法分离抗体分泌阳性的杂交瘤细胞，及后续的简易快速的克隆化培养方法，主要包括4以下步骤1)抗原偶联固相材料的制备通过使用化学方法将欲制备抗体的蛋白通过特定 的化学基团之间的反应偶联到相应的固相载体上；该载体可以是凝胶类物质，也可以是带 有磁性的磁性材料。2)动物的免疫，将欲制备抗体的蛋白与弗氏完全佐剂(初次免疫)或 弗氏不完全佐剂(加强免疫)混合后充分乳化，取乳化后的抗原免疫Balb/C小鼠。3)免疫 后的Balb/C小鼠经过血清效价检测合格后，通过常规的方法进行细胞融合。4)融合后的细 胞在体外用HAT选择性培养基培养3天以后，与偶联有靶抗原固相材料进行孵育后将分泌 特异性抗体的 根据本专利技术方法的一个优选实施方案，其中作为免疫原的蛋白质是人血清白蛋 白。 根据本专利技术方法的一个优选实施方案，特征在于使用包被有特异性抗原的固相介 质为磁性介质(磁珠)。 根据本专利技术的一个优选实施方案，其中用于鉴定和筛选抗体的包括酶联免疫吸 附、免疫印记方法。 目前单克隆抗体仍然是最为可靠的分子识本文档来自技高网...

【技术保护点】
提高特异性单克隆抗体筛选效率的方法，该方法包括：（１）首先用经过相应抗原包被（偶联）的固相介质的制备；（２）然后用所制备的抗原偶联后的固相介质对细胞融合后的杂交瘤细胞进行免疫亲和筛选，获得的杂交瘤细胞进行进一步的克隆化培养；（３）最后再用已知方法鉴定杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体的特异性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高建恩，王春香，
申请(专利权)人：北京康为世纪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]