制备加载mRNA的脂质纳米颗粒的改进方法技术

本发明专利技术提供了一种用于脂质纳米颗粒配制和mRNA包封的改进方法。在一些实施方案中，本发明专利技术提供了一种将信使RNA(mRNA)包封在脂质纳米颗粒中的方法，所述方法包括在环境温度下混合含有低柠檬酸盐浓度的mRNA溶液与脂质溶液的步骤。因此，本发明专利技术提供了一种将mRNA包封到脂质纳米颗粒中的有效、可靠、节能且成本效益高的方法。高的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备加载mRNA的脂质纳米颗粒的改进方法
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2020年10月12日提交的美国临时申请序列号63/090,513的优先权，将所述临时申请的公开内容通过引用特此并入。

技术介绍

[0002]信使RNA疗法(MRT)正在变成越来越重要的用于治疗多种疾病的方法。MRT涉及将信使RNA(mRNA)施用至需要所述疗法的患者，以用于在患者体内产生由所述mRNA编码的蛋白质。通常使用脂质纳米颗粒来包封mRNA，以在体内高效递送mRNA。为了改善脂质纳米颗粒的递送，许多尝试都集中在鉴定可以实现mRNA的细胞内递送和/或表达并且可改变为可扩展且成本效益高的制造工艺的新型方法和组合物上。

技术实现思路

[0003]本专利技术尤其提供了一种用于制备包含加载mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA
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LNP)的组合物的改进、高效且成本效益高的方法。本专利技术基于以下令人惊讶的发现，即在环境温度下混合含有低浓度柠檬酸盐(即，≤5mM)的mRNA溶液与脂质溶液(不预先加热mRNA溶液和/或脂质溶液)导致高的包封效率、mRNA回收率以及更均匀且更小的粒度。因此，在一个方面，本专利技术提供了一种将mRNA包封到脂质纳米颗粒中的有效、可靠、节能、成本效益高且更安全的方法，所述方法可以在无需使用加热和高能量的情况下用于大规模制造工艺以用于治疗应用。
[0004]在一个方面，本专利技术尤其提供了一种将信使RNA(mRNA)包封在脂质纳米颗粒(LNP)中的方法，所述方法包括将(a)包含一种或多种mRNA的mRNA溶液与(b)包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质和一种或多种经PEG修饰的脂质的脂质溶液混合的步骤，以在LNP形成溶液中形成包封在LNP内的mRNA(mRNA
‑
LNP)，其中所述mRNA溶液包含小于5mM的柠檬酸盐，并且其中所述mRNA
‑
LNP的包封效率大于60％。
[0005]在一些实施方案中，mRNA溶液和脂质溶液在混合前处于环境温度下。在一些实施方案中，将mRNA溶液和脂质溶液在环境温度下混合。在一些实施方案中，mRNA溶液和脂质溶液在混合后处于环境温度下。在一些实施方案中，在无需加热的情况下在环境温度下进行将mRNA包封在脂质纳米颗粒内的方法。
[0006]在一些实施方案中，所述环境温度小于约35℃。在一些实施方案中，所述环境温度小于约32℃。在一些实施方案中，所述环境温度小于约30℃。在一些实施方案中，所述环境温度小于约28℃。在一些实施方案中，所述环境温度小于约26℃。在一些实施方案中，所述环境温度小于约25℃。在一些实施方案中，所述环境温度小于约24℃。在一些实施方案中，所述环境温度小于约23℃。在一些实施方案中，所述环境温度小于约22℃。在一些实施方案中，所述环境温度小于约21℃。在一些实施方案中，所述环境温度小于约20℃。在一些实施方案中，所述环境温度小于约19℃。在一些实施方案中，所述环境温度小于约18℃。在一些实施方案中，所述环境温度小于约16℃。
[0007]在一些实施方案中，所述环境温度的范围为约15℃
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35℃。在一些实施方案中，所述环境温度的范围为约16℃
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32℃。在一些实施方案中，所述环境温度的范围为约17℃
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30℃。在一些实施方案中，所述环境温度的范围为约18℃
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30℃。在一些实施方案中，所述环境温度的范围为约20℃
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28℃。在一些实施方案中，所述环境温度的范围为约20℃
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26℃。在一些实施方案中，所述环境温度的范围为约20℃
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25℃。在一些实施方案中，所述环境温度的范围为约21℃
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24℃。在一些实施方案中，所述环境温度的范围为约21℃
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23℃。
[0008]在一些实施方案中，所述环境温度为约16℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约18℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约20℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约21℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约22℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约23℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约24℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约25℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约26℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约27℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约28℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约30℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约31℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约32℃。
[0009]在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约10mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约8.6mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约6.0mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约5.0mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约4.0mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约3.5mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约3.0mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约2.5mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约2.0mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约1.5mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约1.25mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约1.0mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约0.9mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约0.8mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约0.7mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约0.6mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约0.5mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约0.4mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约0.3mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约0.25mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约0.2mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约0.1mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于约0.05mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含约0mM的柠檬酸盐缓冲液。
[0010]在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含约0
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10mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含约1.5
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7.5mM的柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含约2.0
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5.0mM的柠檬酸盐缓冲液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种将信使RNA(mRNA)包封在脂质纳米颗粒(LNP)中的方法，所述方法包括将(a)包含一种或多种mRNA的mRNA溶液与(b)包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质和一种或多种经PEG修饰的脂质的脂质溶液混合的步骤，以在LNP形成溶液中形成包封在LNP内的mRNA(mRNA
‑
LNP)，其中所述mRNA溶液包含小于5mM的柠檬酸盐，并且其中所述mRNA
‑
LNP的包封效率大于60％。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA溶液和/或所述脂质溶液在混合前处于环境温度下。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述环境温度小于约35℃、小于约30℃、小于约26℃、小于约23℃、小于约21℃、小于约20℃或小于约18℃。4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述环境温度的范围为约18℃
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32℃、约21℃
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26℃或约23℃
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25℃。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA溶液包含小于约4.0mM的柠檬酸盐、小于约3.0mM的柠檬酸盐、小于约2.5mM的柠檬酸盐、小于约2.0mM的柠檬酸盐、小于约1.5mM的柠檬酸盐、小于约1.25mM的柠檬酸盐、小于约1.0mM的柠檬酸盐或小于约0.5mM的柠檬酸盐。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA溶液包含约3.0mM的柠檬酸盐。7.根据权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中所述mRNA溶液包含约2.5mM的柠檬酸盐。8.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的方法，其中所述mRNA溶液包含约2.0mM的柠檬酸盐。9.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的方法，其中所述mRNA溶液包含约1.5mM的柠檬酸盐。10.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的方法，其中所述mRNA溶液包含0mM的柠檬酸盐。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA溶液进一步包含海藻糖。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法不需要在所述混合步骤前加热所述mRNA溶液和所述脂质溶液的步骤。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA溶液包含每12L的所述mRNA溶液大于约1g的mRNA。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述mRNA溶液包含每8L的所述mRNA溶液约1g的mRNA。15.根据权利要求13所述的方法，其中所述mRNA溶液包含每4L的所述mRNA溶液约1g的mRNA。16.根据权利要求13所述的方法，其中所述mRNA溶液包含每2L的所述mRNA溶液约1g的mRNA。17.根据权利要求13所述的方法，其中所述mRNA溶液中mRNA的浓度大于约0.125mg/mL、大于约0.25mg/mL、大于约0.5mg/mL或大于约1.0mg/mL。18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述mRNA溶液与所述脂质溶液以在2:1与6:1之间的比率(v/v)混合。
19.根据权利要求18所述的方法，其中将所述mRNA溶液与所述脂质溶液以约4:1的比率(v/v)混合。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA溶液的pH在3.0与5.0之间。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述mRNA溶液的pH为约3.5、4.0或4.5。22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA溶液包含约37.5mM至300mM的NaCl。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述mRNA溶液包含约37.5mM、约75mM、约100mM、约150mM或约300mM的NaCl。24.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA溶液包含约2.5mM的柠檬酸盐、约150mM的NaCl和约4.5的pH。25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括孵育所述mRNA
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LNP的步骤。26.根据权利要求25所述的方法，其中将所述mRNA
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LNP在21℃与65℃之间的温度下孵育。27.根据权利要求26所述的方法，其中将所述mRNA
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LNP在约26℃、约30℃或约65℃的温度下孵育。28.根据权利要求25
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27中任一项所述的方法，其中将所述mRNA
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LNP孵育大于约20分钟、约30分钟、约60分钟、约90分钟或约120分钟。29.根据权利要求28所述的方法，其中将所述mRNA
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LNP孵育约60分钟。30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液包含小于50％、小于25％、小于20％、小于10％、小于5％的非水溶剂，如乙醇。31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液进一步包含一种或多种基于胆固醇的脂质。32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过切向流过滤纯化所述mRNA
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LNP。33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA
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LNP的平均大小小于150nm...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：翻译生物公司，
类型：发明
国别省市：