一种用于蛋白质递送的多级响应型聚合物囊泡的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于蛋白质递送的多级响应型聚合物囊泡的制备方法，涉及生物材料及生物医学领域。本发明专利技术以RNaseA为蛋白模型，制备了载蛋白聚合物囊泡，具有较高的包封率和载药量。药量。

【技术实现步骤摘要】
一种用于蛋白质递送的多级响应型聚合物囊泡的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物材料及生物医学领域，具体涉及一种用于蛋白质递送的多级响应型聚合物囊泡的制备方法。

技术介绍

[0002]蛋白质调节几乎所有的生物过程(如信号转导、细胞代谢、基因转录和翻译、有丝分裂、细胞增殖和凋亡)。因此，几乎所有的病变过程都与特定蛋白质功能异常有关。由于蛋白质极高的精确度和多功能性，蛋白质疗法被认为是一种治疗各种疑难杂症的有效治疗方法。与传统化学药物相比，基于蛋白质的治疗方法具有更高的特异性，更低的不良反应和更短的药物开发周期。与基因类药物相比，蛋白质可以更直接地作用于靶标，并特异性地调节生物过程，从而避免了永久性基因突变以及由于持续性基因表达引起的脱靶效应和致癌风险。迄今为止，多种蛋白质疗法(如胰岛素，单克隆抗体，细胞因子，转录因子，酶和肽等)已被开发为用于治疗糖尿病，癌症，心血管疾病和细菌感染等疾病的药物。基于蛋白质的疗法是市场上增长最快的药物之一，并且已经彻底改变了制药行业。但是，目前临床应用的蛋白类药物的治疗靶点仅位于细胞外部，如细胞膜外表面上的受体，如程序性细胞死亡蛋白1(PD1)、人表皮生长因子受体2(HER2)、分化抗原簇20(CD20)、胰岛素受体等；或胞外可溶性细胞因子，如肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素12(IL12)、血管内皮生长因子(VEGF)等)。据估计，超过70％的基因组编码蛋白质位于细胞内部，然而由于蛋白质表面电荷复杂且尺寸较大，蛋白质药物的胞内靶点输送仍然是一个挑战。为了充分发挥蛋白质的治疗潜力，需要开发合适且多功能的蛋白质输送载体以实现蛋白质药物的跨细胞运输。
[0003]目前已开发的蛋白质输送载体有脂质体，内泌体，无机纳米粒子，纳米凝胶和聚合物等。由于蛋白质是一种具有不确定的电荷性质和大尺寸的生物分子，分子表面可用于与载体结合的位点数量有限，且蛋白质的化学修饰过程通常是不可逆的，传统的载体结合方式可能会影响蛋白质活性。因此，为保持蛋白质分子结构，且保护蛋白质免受血液清除机制的影响，蛋白质输送系统必须提供足够大的亲水口袋，以便有效地封装蛋白质。对于靶点在细胞内的生物大分子，若需要进入细胞并发挥生物学功能，调控细胞生理活动，除了跨越运输过程中各种生物障碍，包括其在血液循环中的稳定及长时间循环、在病理组织中的选择性积累以及跨膜输送以外，更大的挑战是内涵体逃逸、在细胞质内释放等。

技术实现思路

[0004]为解决现有技术的问题，本专利技术提供一种用于蛋白质递送的多级响应型聚合物囊泡的制备方法。
[0005]本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：
[0006]一种用于蛋白质递送的多级响应型聚合物囊泡的制备方法，包括如下步骤：
[0007]1.聚合物的合成
[0008](1)PLys(ss
‑
DBCO/CAA)的合成
[0009]1)PLys的合成
[0010]①
在惰性气体环境中，将三氟乙酰基
‑
L
‑
赖氨酸环内酸酐(Lys(TFA)
‑
NCA)粉末溶解在无水N,N
‑
二甲基甲酰胺(DMF)中，得到Lys(TFA)
‑
NCA溶液，随后将正丁胺的二氯甲烷(DCM)溶液加入到上述Lys(TFA)
‑
NCA溶液中，引发开环聚合反应。将反应体系置于25℃
‑
30℃油浴中搅拌48
‑
72小时，反应液在预冷的乙醚中沉淀收集并进行真空干燥，得到PLys(TFA)白色固体。
[0011]②
将PLys(TFA)溶解在含NaOH的甲醇溶液中，随后将反应体系置于25
‑
30℃油浴中搅拌12
‑
24小时以脱去TFA保护基团，反应液转移至透析袋中进行透析，随后将透析后的样品冷冻干燥，得到PLys白色固体：
[0012][0013]其中，所述正丁胺与Lys(TFA)
‑
NCA的摩尔比为1∶90；所述Lys(TFA)
‑
NCA溶液的浓度为0.1
‑
0.25mg/mL，优选为0.25mg/mL；所述正丁胺的DCM溶液中正丁胺与DCM的体积比为1∶9；所述Lys(TFA)
‑
NCA与含NaOH的甲醇溶液的比例为0.37
‑
5mmol∶5
‑
20mL，优选为3.7mmol∶5mL。
[0014]基于以上技术方案，优选的，所述惰性气体为氩气或氮气。
[0015]基于以上技术方案，优选的，所述含NaOH的甲醇溶液中NaOH的浓度为1
‑
2M，优选为1M。
[0016]基于以上技术方案，优选的，所述透析袋的截留分子量(MWCO)为3000
‑
5000Da，优选为3500Da。
[0017]基于以上技术方案，优选的，所述透析为先在HCl溶液中透析，再在超纯水中透析，所述透析时间为18
‑
72小时，其中HCl溶液中透析9
‑
36小时，超纯水中透析9
‑
36小时；HCl溶液的浓度为0.01M。例如分别在0.01M HCl溶液中和超纯水中透析三次，每次透析时间为3
‑
12小时。
[0018]2)PLys(ss
‑
DBCO)的合成
[0019]将二苯并环辛炔
‑
二硫键
‑
羧酸(DBCO
‑
ss
‑
COOH)溶于DMF中，加入1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC
·
HCl)和N
‑
羟基丁二酰亚胺(NHS)，随后将反应体系置于25
‑
30℃油浴中搅拌3
‑
5小时以活化羧基，得到羧基活化后的反应液。将PLys固体溶解在Hepes缓冲液中，并加入到上述羧基活化后的反应液中，之后将反应体系置于25
‑
30℃油浴中搅拌12
‑
24小时后，反应液转移至透析袋中进行透析，随后将透析后的样品冷冻干燥，得到PLys(ss
‑
DBCO)白色固体：
[0020][0021]其中，所述DBCO
‑
ss
‑
COOH与EDC.HCl、NHS的摩尔比为1∶1.2
‑
1.5∶1.2
‑
1.5，优选为1∶1.5∶1.5；所述DBCO
‑
ss
‑
COOH与DMF的比例为9.8μmol：4.0mL；所述Plys在Hepes缓冲液中的浓度为5.0
‑
10.0mg/mL，优选为9.0mg/mL；所述DBCO
‑
ss
‑
COOH与P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于蛋白质递送的多级响应型聚合物囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将RNase A溶于Hepes缓冲液中，得到RNase A的溶液；(2)将RGD
‑
PEG
‑
PLys(N3)与PLys(ss
‑
DBCO/CAA)分别溶于Hepes缓冲液中，分别得到RGD
‑
PEG
‑
PLys(N3)溶液和PLys(ss
‑
DBCO/CAA)溶液；(3)将上述RGD
‑
PEG
‑
PLys(N3)溶液与PLys(ss
‑
DBCO/CAA)溶液同时加入到RNase A缓冲液中，25
‑
30℃搅拌24
‑
48小时后，离心，得到载蛋白聚合物囊泡。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述RNase A溶液的浓度为0.25
‑
1mg/mL；所述RGD
‑
PEG
‑
PLys(N3)溶液和PLys(ss
‑
DBCO/CAA)溶液的浓度均为0.5mg/mL，RGD
‑
PEG
‑
PLys(N3)溶液、PLys(ss
‑
DBCO/CAA)溶液与RNase A溶液的体积比为1∶1∶10
‑
20；所述Hepes缓冲液的pH为7.4。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述PLys(ss
‑
DBCO/CAA)的合成方法，包括如下步骤：1)PLys的合成
①
在惰性气体中，将Lys(TFA)
‑
NCA粉末溶解在无水N，N
‑
二甲基甲酰胺中，得到Lys(TFA)
‑
NCA溶液，随后将正丁胺的二氯甲烷溶液加入到上述Lys(TFA)
‑
NCA溶液中，于25℃
‑
30℃油浴中搅拌48
‑
72小时，反应液使用乙醚进行沉淀，并进行真空干燥，得到PLys(TFA)白色固体；
②
将PLys(TFA)溶解在含NaOH的甲醇溶液中，于25
‑
30℃油浴中搅拌12
‑
24小时，对反应液进行透析，随后将透析后的样品冷冻干燥，得到PLys白色固体：2)PLys(ss
‑
DBCO)的合成将DBCO
‑
ss
‑
COOH溶于N,N
‑
二甲基甲酰胺中，加入1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC
·
HCl)和N
‑
羟基丁二酰亚胺(NHS)，于25
‑
30℃油浴中搅拌3
‑
5小时，得到羧基活化后的反应液；将PLys固体溶解在Hepes缓冲液中，并加入到上述羧基活化后的反应液中，于25
‑
30℃油浴中搅拌12
‑
24小时，对反应液进行透析，随后将透析后的样品冷冻干燥，得到PLys(ss
‑
DBCO)白色固体：3)PLys(ss
‑
DBCO/CAA)的合成将PLys(ss
‑
DBCO)溶解在NaHCO3缓冲液中，再加入CAA，于0
‑
4℃下搅拌2
‑
4小时，对反应
液进行离心，冷冻干燥，得到PLys(ss
‑
DBCO/CAA)白色固体：4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述RGD
‑
PEG
‑
PLys(N3)的合成方法，包括如下步骤：1)RGD
‑
PEG
‑
NH2的合成
①
将cRGDfk溶解在NaHCO3缓冲液中，再加入NHS
‑
PEG
‑
NH
‑
BOC，于25
‑
30℃油浴中搅拌3
‑
5小时，对反应液进行离心，冷冻干燥，得到RGD
‑
PEG
‑
NH
‑
BOC白色固体；
②
将RGD
‑
PEG
‑
NH
‑
BOC溶解在HCl溶液中，于25
‑
30℃油浴中搅拌12
‑
24小时，对反应液进行透析，随后将透析后的样品冷冻干燥，得到RGD
‑
PEG
‑
NH2白色固体：2)RGD
‑
PEG
‑
PLys的合成
①
对RGD
‑
PEG
‑
NH2进行干燥处理：将RGD
‑
PEG
‑
NH2溶解在二氯甲烷中，加入苯混合均匀，冷冻并用冷肼减压抽干，随后转移至无水无氧的环境中，得到干燥处理后的RGD
‑
PEG
‑
NH2；
②
在惰性气体中，将干燥处理后的RGD
‑
PEG
‑
NH2溶解于N，N
‑
二甲基甲酰胺中，得到RGD
‑
PEG
‑
NH2的N，N
‑
二甲基甲酰胺溶液；在惰性气体中，将Lys(TFA)
‑
NCA溶解在N,N
‑
二甲基甲酰胺中，得到Lys(TFA)
‑
NCA的N，N
‑
二甲基甲酰胺溶液；之后将RGD
‑
PEG
‑
NH2的N，N
‑
二甲基甲酰胺溶液和Lys(TFA)
‑
NCA的N，N
‑
二甲基甲酰胺溶液混合，置于25
‑
30℃油浴中搅拌48
‑
72小时，反应液使用乙醚进行沉淀，并进行真...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈麒先，王静云，崔洪燕，郑浩男，李海东，张留伟，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：