高活性重组热敏型UDG突变体及其原核表达载体制造技术

本发明专利技术提供一种高活性重组热敏型UDG突变体，其特征为：其氨基酸序列如SEQ ID NO：1、2或5中任一条所示。还公开了其原核表达载体。本发明专利技术在野生型热敏UDG(psychrophilicmarine bacterium)的基础上进行点突变，突变体能够显著提高UDG的热敏性，提高该酶在体外对含U模板的消化能力。通过在载体在N端融合表达SUMO蛋白，该重组蛋白可在大肠杆菌原核表达系统中进行上清表达后经亲和纯化大量获得。能够对qPCR等反应体系有更高的兼容性。其中效果最佳者为UDGm

【技术实现步骤摘要】
cloning,sequencing,and expressing of the heat
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labile uracile
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DNA Glycosylase from a marine psychrophilic bacterium,strain BMTU 3346]基础上分别进行His72Asn；Ser77Ala；Ala134Ser；Lys171His及Asn143Ser的单一位点突变，得到mUDG1～5，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1～5所示。然后在突变后蛋白序列的N端融合SUMO标签，使用大肠杆菌原核表达系统进行上清表达。构建的原核表达载体结构为：pET28a
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N6H
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SUMO
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UDGm，N6H为N端His标签，SUMO为SUMO标签。
[0011]N6H
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SUMO与UDGm间通过rTEV酶切位点连接，所述rTEV酶切位点的氨基酸序列为Glu
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Asn
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Leu
‑
Tyr
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Phe
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Gln
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Gly(剪切位点在Gln
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Gly之间)具体核酸序列为GAAAACCTGTATTTCCAGGGT。
[0012]本专利技术在野生型热敏UDG(psychrophilic marine bacterium)的基础上进行点突变，突变体能够显著提高UDG的热敏性，提高该酶在体外对含U模板的消化能力。通过在载体在N端融合表达SUMO蛋白，该重组蛋白可在大肠杆菌原核表达系统中进行上清表达后经亲和纯化大量获得。能够对qPCR等反应体系有更高的兼容性。其中效果最佳者为mUDG1；mUDG2；mUDG5。
附图说明
[0013]图1重组UDG载体构建示意图。
[0014]图2mUDGs突变体全U模板消化能力及热稳定性检测。
[0015]图3mUDGs突变体纯化效果图。
[0016]图4UDG突变体与野生型UDG对全U模板消化能力测试对比。
[0017]图5UDG突变体与野生型UDG热稳定性测试。
[0018]图6UDG与已有UDG产品在qPCR体系兼容性测试与非UDG体系对照。
[0019]图2、3、5中m1代表mUDG1，m2代表mUDG2，m3代表mUDG3，m4代表mUDG4，m5代表mUDG5。
具体实施方式
[0020]下面结合附图对本专利技术的具体实施方式做进一步说明。本实施例使用的引物序列如表1所示。
[0021]表1：引物序列
[0022]SEQ ID No.序列名称5
’‑3’
1mUDG1
‑
FTCCGACGCCGGGTAATCC2mUDG1
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RCAGGCCAATCGGATTACCCG3mUDG2
‑
FTCATCCGATTGGCCTGGCCTTTG4mUDG2
‑
RTCCACGGCAAAGGCCAGGC5mUDG3
‑
FTGCGTGCAGGTGCATCGGC6mUDG3
‑
RGCGATGGCTGGCCGATGCAC7mUDG4
‑
FGGCAATGATGCACGTTCTATGGCAC8mUDG4
‑
RGAACTGGTGCCATAGAACGTGCATC9mUDG5
‑
FTATTGAAAGCCCGCATAACAGCC10mUDG5
‑
RCGCTCAGTGGGCTGTTATGC
11UDGsub
‑
FTCTCGTTTCATCGGTATCAT12UDGsub
‑
RTCATCAGCGTGGTCGTG13hGAPDH
‑
FGAAGGTGAAGGTCGGAGT14hGAPDH
‑
RGAAGATGGTGATGGGATTTC15hGAPDH
‑
PCAAGCTTCCCGTTCTCAGCC 5
’6‑
FAM，3
’
BHQ116hGAPDH
‑
PCAAGCTTCCCGTTCTCAGCC 5
’
VIC，3
’
BHQ1
[0023]实施例1：重组热敏UDG突变体粗酶对全U模板及热稳定性检测
[0024]在本实施例中，根据热敏UDG的活性位点及DNA结合位点，挑选了一些保守的活性氨基酸位点进行突变，随后，测试热敏UDG突变体酶原液的性能。具体实施方式如下：
[0025]1)热敏UDG突变体原核表达菌株的制备
[0026]首先在野生型UDG序列N端连接N6H
‑
SUMO序列，并以rTEV识别序列与UDG序列进行连接，N6H
‑
SUMO氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。载体结构为pET28a
‑
N6H
‑
SUMO
‑
UDG。野生型N6H
‑
SUMO
‑
rTEV
‑‑
UDG的DNA序列如SEQ ID NO：7所示。在野生型的UDG作为突变处设计点突变引物参考点突变试剂盒说明书进行扩增及消化(Yeasen，11003ES10)，并转化到DH5α大肠杆菌感受态中，涂布到含卡那霉素的LB固体平板上37℃倒置培养过夜。
[0027]挑取状态良好的单克隆菌落于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm/min,震荡培养将菌液进行一代Sanger测序验证。
[0028]将测序验证成功的菌株进行质粒抽提，获得pET
‑
28a
‑
UDG突变体表达质粒，并转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态中，涂布到含卡那霉素的LB固体平板上，37℃倒置培养过夜。挑去状态良好的单克隆菌落于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm/min,震荡培养至OD600达到0.6。加入终浓度为0.1mM IPTG，16℃过夜震荡诱导。
[0029]2)热敏UDG突变体酶原液的纯化
[0030]按照1:100的接种密度将含pET
‑
28a
‑
UDG突变体表达质粒的BL21(DE3)大肠杆菌接种至新的含卡那霉素的LB培养基中，37℃震荡培养3h至OD600值达到0.5，加入终浓度为0.1mM的IPTG，18℃震荡培养18h。4000g 4℃离心收集菌体并称重保存于
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80℃。按照菌重：破菌液1:10的比例重悬，在冰上进行超声破碎(超声2s停止4s)，12000g 4℃离心取上清后经Ni纯化后，获得热敏UDG粗酶液。
[0031]3)热敏UDG性能测试
[0032]将热敏UDG酶原液进行含U产物消化能力测试、热敏本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高活性重组热敏型UDG突变体，其特征为：其氨基酸序列如SEQ ID NO：1、2或5中任一条所示。2.权利要求1所述的高活性重组热敏型UDG突变体的原核表达载体。3.根据权利要求2所述的原核表达载体，其特征在于：载体采用pET28a质粒，载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋东亮，邬升杨，韦磊，李婕，刘想，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：