一种耐热木糖苷酶突变体及其制备制造技术

本发明专利技术属于酶的基因工程技术邻域，具体涉及一种酶活性和热稳定性提升的β

【技术实现步骤摘要】
一种耐热木糖苷酶突变体及其制备

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[0001]本专利技术属于酶的基因工程
，具体涉及一种活力和热稳定性能提升的木糖苷酶突变体及其制备与应用。

技术介绍
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[0002]β
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木糖苷酶(β
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Xylosidase，XYL，EC 3.2.1.37)，是一种外切酶，主要催化水解木糖苷和以外切方式从非还原性末端水解聚合度较低的木寡糖(木二糖或木三糖)为木糖。同时β
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木糖苷酶还可以作用于萜类、甾体等甙元与木糖形成的糖苷键，释放出甙元。目前，包括XYL在内的木聚糖酶系降解木聚糖，已经被广泛应用于食品、医药、造纸、饲料、能源等多个领域。在食品工业中，β
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木糖苷酶可用于烘焙，烘焙使用的面粉中含有2％
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3％的阿拉伯木聚糖，将含有β
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木糖苷酶的木聚糖降解酶混合物加入到面粉中能够释放滞留在阿拉伯木聚糖中的水分，从而改善面团的可加工性，增加最终产品的体积、改善其面包屑结构，并显著提高面包在消费市场上的保质期；在医药行业，具有转糖基化活性的β
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木糖苷酶可以促进木聚糖形成低聚木糖(XOS)，XOS对人体生理功能有积极影响，如降低胆固醇水平，增加钙的生物利用度，降低结肠癌的风险等；在造纸方面，木聚糖水解酶复合物也用于纸浆和造纸工业中，主要用于在增白之前加工纤维素纸浆。
[0003]XYL在自然界中广泛存在，目前已经从细菌、放线菌和真菌(包括霉菌、酵母、蕈菌)等微生物和部分高等植物中分离得到。大多数细菌或真菌只生产一种XYL，据报道，α
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木糖苷酶只来源于大肠杆菌(Escherichia coli)和黑曲霉(Aspergillus niger)；β
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木糖苷酶的来源较多，主要来源于真菌和细菌，如芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和梭状芽孢杆菌属(Closyridium sp.)等。目前，在11个不同的GH家族中发现了β
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木糖苷酶，分别是GH家族1、3、5、30、39、43、51、52、54、116和120，这与木聚糖的异质性相适应，而目前已报道的β
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木糖苷酶大部分存在于GH3、GH39和GH43中。
[0004]定向进化是改善蛋白质功能和活性的重要手段之一，尤其在提高蛋白质热稳定性方面。它属于蛋白质的非理性设计，不需要获得蛋白的高级结构以及催化位点等结构，只需对蛋白氨基酸序列做随机突变。它可以在实验室里模拟自然选择的进化机制，通过分子生物学手段在体外快速建立含大量目的蛋白编码基因的突变体文库，并通过高通量的定向筛选方法，快速得到符合人类应用价值的蛋白突变体。定向进化的核心步骤主要包括构建具有多样性的突变体文库和高通量的筛选方法。常用的包括：易错PCR、饱和突变、DNA改组、交错延伸PCR等。定点突变，即理性设计，在蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等基础上，有的放矢对其进行改造，且只能对天然酶蛋白质中的少数氨基酸进行替换、删除或插入，不改变酶蛋白的高级结构，对酶功能的改造有限。因此，对于结构与功能未知的酶，定向进化可在一定程度上弥补理性设计的不足。
[0005]大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉，可以快速大规模地生产目的蛋白等优点，而且其表达外源基因产物的水平远高于其他基因表达系统，表达的目的蛋白
量甚至能超过细菌总量的30％，因此，大肠杆菌表达系统被广泛应用于基因工程中。
[0006]酵母表达系统是一种经济高效的真核蛋白表达系统，可以成功实现胞内表达或是分泌表达，且其放大培养基相对廉价，培养条件要求不高，适宜工业放大。酵母表达系统包括酿酒酵母表达系统、甲醇营养型酵母表达系统、裂殖酵母表达系统，因其是真核细胞，所以具有对蛋白质的翻译、加工和修饰过程，此外，酵母表达系统还具有可将异源基因与N
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末端前导肽融合、可采用高表达基因的强启动子，并可诱导调控、可移去起始甲硫氨酸，避免了作为药物使用可能引起的免疫反应问题等优点。随着生物技术的发展，酵母表达系统将会用于更多外源蛋白的表达，更加广泛应用于多个领域。
[0007]芽孢杆菌表达系统作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛地应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研领域。它可将目的基因表达的产物分泌到胞外，从而降低进一步收集、分离、纯化基因表达产物的成本和工作量。芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等均可作为表达宿主菌。在微生物遗传学领域，芽孢杆菌属背景研究也十分清楚，具有密码子偏爱性不明显、发酵简单、生长迅速、不产生致病毒素、对培养基无特殊要求等优点。随着分子生物学技术的发展和芽孢杆菌研究的深入，使用芽孢杆菌表达系统已经克隆和表达了大量基因，有些已进行大规模工业生产，多种酶和临床需要的化学药品或者工业产品都通过芽孢杆菌来表达生产。

技术实现思路
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[0008]基于现有技术存在的问题，为了进一步推动β
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木糖苷酶在工业领域的应用，需对其现有性质进一步的提升，本专利技术的目的在于提供一种酶活力和热稳定性能提升的β
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木糖苷酶的突变体。
[0009]实现本专利技术目的的技术路线概述如下：
[0010]通过基本的分子生物学技术手段获得克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)野生型XYL编码基因，通过酶切、连接等构建重组载体之后，经测序获得野生型xyl序列(如SEQ ID NO.2所示)，利用易错PCR技术对野生型XYL编码基因进行随机突变，利用大肠杆菌表达系统筛选得到XYL突变体S51L，及其编码基因xylm，重新构建重组载体，并实现了其在大肠杆菌、毕赤酵母菌、枯草芽孢杆菌的高效表达，通过发酵、提取等技术获得酶活力和热稳定性能提高的XYL突变体。
[0011]本专利技术提供的技术方案之一，是一种β
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木糖苷酶(XYL)突变体S51L，是在SEQ ID NO.1所示的野生型XYL的氨基酸序列基础上发生第51位S51L突变获得的；
[0012]进一步地，所述S51L突变体，具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
[0013]本专利技术提供的技术方案之二，是S51L突变体的编码基因；
[0014]进一步地，所述S51L突变体的编码基因，具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
[0015]本专利技术提供的技术方案之三，是表达上述S51L突变体或其编码基因的重组载体或重组菌株；
[0016]进一步地，所述重组载体采用的表达质粒为pET
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22b、pPIC9K或pLY
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3质粒；
[0017]进一步地，所述重组菌株采用的宿主细胞包括但不限于：大肠杆菌BL21(DE3)、毕赤酵母菌GS115或者枯草芽孢杆菌WB600。
[0018]本专利技术提供本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种β
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木糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体为S51L，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。2.权利要求1所述β
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木糖苷酶突变体的编码基因。3.权利要求2所述β
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木糖苷酶的编码基因，其特征在于，如序列表SEQ ID NO.4所示。4.一种包含权利要求2所述编码基因的重组载体或重组菌株。5.如权利要求4所述的重组载体或重组菌株，其特征在于，表达载体为pET
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22b，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)；表达载体为pPIC9K，宿主细胞为毕赤酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凤华，刘逸寒，高文静，张晨晨，姚志明，路福平，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：